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通过硫酸铵分步沉淀,亲和层析等方法,作者从蚯蚓(E.fetida)纯化得到了一种表观分子质量约为34kDa的似丝氨酸胰蛋白酶。该酶与血清孵育时,可以迅速识别并降解血清中一个分子质量约为250kDa的蛋白质。通过质谱与western-blotting分析,证明被降解的蛋白为纤维连接蛋白(fibronectin,FN)。当蛋白酶浓度为10 nM时,FN在15min内被明显降解,较作为对照的胰蛋白酶的降解速度快得多。介于该蚯蚓蛋白酶对血清中FN选择性以及表现出的对于蛋白酶浓度和时间的依赖性,作者将其命名为蚯蚓纤连蛋白酶(EFNase)。
通过裂解片断N端氨基酸测序,确定EFNase裂解FN的主要位点为R与K,说明该酶具有典型的胰蛋白酶的特性。FN的降解位点从N端到C端依次为I(R259/A260)、II(R1005/G1006)、III(K1557/T1558)、IV( R2039/H2040)。FN包含多个功能域,推测通过EFNase的降解作用,可能在体内发挥多种功能。特别感兴趣的是影响乙型肝炎病毒与FN之间的相互作用。
作者首先选择HepG2.2.15细胞系研究EFNase对乙型肝炎的作用。以EFNase及spEFNase(蚯蚓蛋白酶同功酶混合物)处理HepG2.2.15,并以拉米夫定做为阳性对照。结果表明:与拉米夫定相比,EFNase及spEFNase对HBeAg的分泌有更显著的抑制作用。高浓度的spEFNase可以降低FN蛋白的表达,RNA含量无显著变化。EFNase对FN的转录和翻译均无显著影响。HBeAg是表征乙型肝炎感染状态的重要指标。所以EFNase和spEFNase对HBeAg抑制将对乙型肝炎的治疗有重要的意义。
然后作者采用C57BL/6J-HBV转基因小鼠研究spEFNase对乙型肝炎的治疗。结果表明,与生理盐水相比,spEFNase可以抑制HBsAg,ALT,AST的分泌,抑制血清及肝组织中FN浓度的上升,对小鼠肝脏病变有一定的缓解作用。
综合上述结果,作者认为蚯蚓纤连蛋白酶将在乙型肝炎的缓解与治疗中发挥一定的作用。与以往的药剂相比,蚯蚓纤连蛋白酶可能具有如下的优势:(1)可以通过降低FN的水平阻断HBV病毒的传播;(2)可以通过降低FN水平延缓肝纤维化的发生。所以蚯蚓纤连蛋白酶有希望发展为一种治疗慢性乙型肝炎的药物。