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背景：严重烧伤后的缺血缺氧性损伤是导致各脏器器官功能障碍乃至功能衰竭的关键。肠黏膜机械屏障功能的破坏对于严重烧伤后全身性炎症反应综合征 （Systematic Inflammatory Response Syndrome SIRS）、多器官功能不全综合征（Multiple Organs Disfunction Syndrome MODS）的发生起关键作用。故在严重烧伤后寻找减轻肠道损伤的途径，对于临床预防、治疗严重烧伤早期肠黏膜的缺血缺氧性损伤有重要意义。热休克蛋白（Heat Shock Proteins HSPs)是生物体(或离体培养细胞)在轻微不良环境因素作用下所产生的一组特殊的蛋白质，它能保护机体(或细胞)在随后的致死性应激中不受或少受伤害。热休克蛋白70(HSP70)是热休克蛋白家族中研究最为广泛的一种。其诱导数量与保护作用的强弱呈正相关。目前提高细胞HSP70含量的方法有两类：诱导内源性HSP70的表达和导入外源性HSP70基因。利用腺病毒作为基因治疗的载体将外源性HSP70基因导入细胞，可提高HSP70基因的表达水平，保护器官功能，以往的实验研究集中于HSP70基因转染对心肌、脑的缺血缺氧性损伤的保护作用，而对肠黏膜的保护研究较少，尤其是利用腺病毒作为真核表达载体转染HSP70基因在肠表达的研究未见报道。故本课题前部分实验运用腺病毒作为真核表达载体，采用DNA-TPC末端蛋白融合的方法(该方法较以往传统腺病毒制备方法更为有效地制备出高滴度的病毒液)，成功制备含HSP70基因的重组腺病毒载体，进行体内外转染实验，研究其对严重烧伤后肠黏膜缺血缺氧性损伤的拮抗作用，可望为减少严重烧伤后大鼠早期肠黏膜的损伤提供可行的保护措施，并为进一步运用于基因治疗打下基础。目前，腺病毒载体临床应用的转染途径主要为静脉注射转染，因其重复治疗存在免疫源性较强从而影响基因转染效率、患者耐受性较差等因素始终无法在临床广泛应用。寻找新的有效、便捷转染途径成为目前腺病毒载体应用治疗研究的热点，也是国内外学者在该领域关注的焦点。而微胶囊工业因其在药物缓释、移植、疫苗佐剂与基因载体等方面的广泛应用，越来越受到重视。微胶囊囊材可将内容物隔离，避免胃液损伤而在肠道控释吸收。口服微胶囊后用扫描电镜与荧光显微镜观察显示微胶囊出现在肝、脾、肠等器官。我们在本实验研究中，为避免腺病毒载体在体治疗的不良反应，<WP=10>尝试口服转染的新途径，率先将微胶囊工艺用于包裹制备的重组腺病毒载体，将构建的腺病毒载体Ad-HSP70微胶囊化，证实包裹后的病毒可体外存活并检测到可有效进行转染实验的高滴度。大鼠口服微胶囊转染后有明确的目的基因表达，对严重烧伤大鼠肠黏膜的缺血缺氧性损伤具有明确的保护效应。目的：通过体内外实验探讨重组腺病毒介导的外源性HSP70基因转染对严重烧伤后肠黏膜缺血缺氧性损伤的保护作用及其相关机制。通过该重组腺病毒载体微胶囊化效应的观察，率先以口服转染的新途径观察其对严重烧伤大鼠肠黏膜缺血缺氧性损伤的保护作用，从而为进一步临床应用奠定基础。方法：第一部分实验首先从国外学者惠赠的质粒中获得HSP70基因，进行点突变修复后获得序列完全正确的全长HSP70cDNA。将已克隆的正确序列HSP70基因片段，末端填平后与cosmid 质粒pAxCAwt连接构建穿梭质粒。将此穿梭质粒经包装并扩增，提纯后与腺病毒DNA-TPC共转染293细胞，通过同源重组成功构建了Ad-HSP70腺病毒重组体，扩增后获得高滴度的Ad-HSP70病毒液。第二部分体外实验将Ad-HSP70腺病毒重组体体外转染肠上皮细胞（IEC-6），观察目的基因在转染细胞中的表达。建立肠上皮细胞体外缺氧-再复氧模型，通过MTT、Annexin-V-Fluos、TUNEL、细胞增殖能力等方法观察Ad-HSP70转染对体外培养的肠上皮细胞缺氧-再复氧损伤的保护作用及其相关机制。第三部分实验为避免腺病毒载体临床应用中的缺陷，将Ad-HSP70重组腺病毒载体微胶囊化，以保护腺病毒躲避胃液损伤，直接进入肠道吸收发挥作用。验证其在人工胃液与肠液中的融出率。该方面研究未见报道。第四部分为体内实验，以本研究所严重烧伤大鼠模型为承载体，进行Ad-HSP70腺病毒重组体静脉注射与腹腔注射转染实验，比较二者在大鼠肠黏膜中的表达，研究Ad-HSP70腺病毒体内转染对严重烧伤大鼠肠黏膜缺血缺氧性损伤的保护作用。同时进行大鼠口服Ad-HSP70腺病毒微胶囊实验。通过大体标本、乳酸脱氢酶、相关细胞因子及内毒素等观察微胶囊化Ad-HSP70对严重烧伤大鼠肠黏膜缺血缺氧性损伤的拮抗效应。结果：一、成功克隆全长HSP70基因，经点突变修复后克隆基因测序，证实与GenBank中报道序列完全相同。二、成功构建了复制缺陷型腺病毒重组体Ad-HSP70，该病毒只有在含E1基因的293细胞中才能复制。经测定病毒滴度高达3.57 ×1010 (pfu/ml)，可进行体内外转染实验。三、Ad-HSP70转染体外培养的肠上皮细胞株(IEC-6)，经RT-PCR、蛋白印迹及免<WP=11>疫组织化学检测，证明腺病毒重组体Ad-HSP70中含有全长HSP70基因并且可在体外培养的肠上皮细胞中成功转录及翻译表达，而转染空载体组细胞没有目的基因的表达(结果为阴性)。四、Ad-HSP70体外转染大鼠肠上皮细胞株(IEC-6)，经缺氧1h再复氧3h?