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研究背景和目的:三阴性乳腺癌是一种雌激素、孕激素、人表皮生长因子受体均表达阴性的乳腺癌亚型。因缺乏特异性靶点，化疗是三阴性乳腺癌治疗的基石，虽然三阴性乳腺癌对初始化疗敏感，但进行多疗程化疗后易出现抵抗。相关研究表明DNA损伤修复、趋化因子等与化疗抵抗密切相关。聚-ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）是DNA损伤修复的重要酶，PARP-1抑制剂是三阴性乳腺癌近来新兴的靶向作用PARP-1的小分子化合物，目前在临床中单独使用只给小部分BRCA基因突变的三阴性乳腺癌及卵巢癌患者带来获益，因此探索新型PARP-1抑制剂、增强PARP-1抑制剂疗效、扩大PARP-1抑制剂适用人群等是十分必要的。PJ34是一种新型的、强效的、菲啶酮类PARP-1竞争性抑制剂，在其他肿瘤（如卵巢癌、非小细胞癌等）研究中显示出抗肿瘤活性，而在三阴性乳腺癌中的研究尚少。研究表明趋化因子受体4（CXCR4）高表达于三阴性乳腺癌，影响乳腺癌的复发、转移及预后；另外，还有研究表明CXCR4与肿瘤细胞的DNA损伤修复、周期调控、凋亡及放化疗敏感性等密切相关。本研究旨在研究新型PARP-1抑制剂PJ34对三阴性乳腺癌MDA-MB231细胞增殖和凋亡的影响及CXCR4是否影响PJ34的细胞毒作用及可能的机制，期望抗CXCR4及PARP-1靶点治疗三阴性乳腺癌的可能性，为三阴性乳腺癌的治疗提供新思路。
材料和方法:
1、体外培养CXCR4高表达的人三阴性乳腺癌MDA-MB231细胞株，应用噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)法分别检测CXCR4抑制剂AMD3100、PARP-1抑制剂PJ34、Olaparib对三阴性乳腺癌MDA-MB231细胞24h、48h增殖情况的影响；以48h为观察点，检测AMD3100与PJ34联合后对MDA-MB231细胞增殖情况的影响；通过瞬时转染敲减CXCR4后，检测PJ34对MDA-MB231细胞IC50的变化；通过平板克隆实验检测PJ34单药、联合AMD3100及敲减CXCR4后细胞的克隆形成能力。
2、流式细胞术分析PJ34单药、联合AMD3100及敲减CXCR4后细胞周期及凋亡的变化。
3、Westernblot技术检测PJ34单药、联合AMD3100及敲减CXCR4后细胞凋亡相关蛋白及AKT、p-AKT的变化。
4、Westernblot、RT-PCR技术检测PJ34单药、联合AMD3100及敲减CXCR4后细胞CXCR4及PARP-1表达的变化。
5、采用cBioPortal数据库分析乳腺癌标本中CXCR4和PARP-1的表达情况。
结果:1、MTT实验结果显示AMD3100、PJ34、Olaprib均对MDA-MB231细胞的增殖具有抑制作用，且呈时间及浓度的依赖性，对MDA-MB231而言PJ34抑制细胞增殖的作用较Olaparib强（药物作用IC50：PJ34<100μmol/mlVSOlaprib>100μmol/ml，且p<0.05）；AMD3100与PJ34联合后比单药对细胞的增殖抑制作用强，且二者具有协同作用，CI<1;平板克隆实验也显示联合组较单药及对照组抑制细胞克隆能力强，克隆形成率明显低（p<0.05）；同时进行CXCR4敲减与NC对比，PJ34处理细胞48h的半数抑制浓度分别为：ShCXCR4组36.88±0.45μmol/ml、ShNC组44.925±0.165μmol/ml.且P<0.05，表明抑制CXCR4后能够增强PJ34的细胞毒作用。
2、PJ34处理MDA-MB231细胞48h后，能诱导细胞阻滞于G0/G1期及促进凋亡，联合AMD3100及敲减CXCR4后能使G0/G1期及凋亡细胞比例增加。
3、Westernblot结果显示PJ34处理细胞48h后，抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2表达下降，联合AMD3100及敲减CXCR4后能Mcl-1、Bcl-2表达进一步下降，同时使p-AKT蛋白表达下降。
4、Westernblot、RT-PCR结果显示PJ34处理细胞48h后CXCR4、PARP-1在蛋白及基因水平表达下降；联合AMD3100及敲减CXCR4后CXCR4、PARP-1在蛋白及基因水平表达进一步下降。
5、cBioPortal数据分析显示乳腺癌患者组织样本中CXCR4与PARP-1呈共生关系，且二者mRNA的表达呈正相关。
结论:
1、PJ34对MDA-MB231细胞具有增殖抑制作用，且呈时间及浓度依赖性；并能诱导MDA-MB231细胞凋亡。
2、CXCR4抑制剂AMD3100及敲减CXCR4能使PJ34抑制细胞增殖及诱导凋亡的作用增强；其可能原因是使pAKT、Bcl-2、Mcl-1表达下降，从而促进细胞凋亡；同时，PARP-1与CXCR4之间可能存在调节关系。
材料和方法:
1、体外培养CXCR4高表达的人三阴性乳腺癌MDA-MB231细胞株，应用噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)法分别检测CXCR4抑制剂AMD3100、PARP-1抑制剂PJ34、Olaparib对三阴性乳腺癌MDA-MB231细胞24h、48h增殖情况的影响；以48h为观察点，检测AMD3100与PJ34联合后对MDA-MB231细胞增殖情况的影响；通过瞬时转染敲减CXCR4后，检测PJ34对MDA-MB231细胞IC50的变化；通过平板克隆实验检测PJ34单药、联合AMD3100及敲减CXCR4后细胞的克隆形成能力。
2、流式细胞术分析PJ34单药、联合AMD3100及敲减CXCR4后细胞周期及凋亡的变化。
3、Westernblot技术检测PJ34单药、联合AMD3100及敲减CXCR4后细胞凋亡相关蛋白及AKT、p-AKT的变化。
4、Westernblot、RT-PCR技术检测PJ34单药、联合AMD3100及敲减CXCR4后细胞CXCR4及PARP-1表达的变化。
5、采用cBioPortal数据库分析乳腺癌标本中CXCR4和PARP-1的表达情况。
结果:1、MTT实验结果显示AMD3100、PJ34、Olaprib均对MDA-MB231细胞的增殖具有抑制作用，且呈时间及浓度的依赖性，对MDA-MB231而言PJ34抑制细胞增殖的作用较Olaparib强（药物作用IC50：PJ34<100μmol/mlVSOlaprib>100μmol/ml，且p<0.05）；AMD3100与PJ34联合后比单药对细胞的增殖抑制作用强，且二者具有协同作用，CI<1;平板克隆实验也显示联合组较单药及对照组抑制细胞克隆能力强，克隆形成率明显低（p<0.05）；同时进行CXCR4敲减与NC对比，PJ34处理细胞48h的半数抑制浓度分别为：ShCXCR4组36.88±0.45μmol/ml、ShNC组44.925±0.165μmol/ml.且P<0.05，表明抑制CXCR4后能够增强PJ34的细胞毒作用。
2、PJ34处理MDA-MB231细胞48h后，能诱导细胞阻滞于G0/G1期及促进凋亡，联合AMD3100及敲减CXCR4后能使G0/G1期及凋亡细胞比例增加。
3、Westernblot结果显示PJ34处理细胞48h后，抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2表达下降，联合AMD3100及敲减CXCR4后能Mcl-1、Bcl-2表达进一步下降，同时使p-AKT蛋白表达下降。
4、Westernblot、RT-PCR结果显示PJ34处理细胞48h后CXCR4、PARP-1在蛋白及基因水平表达下降；联合AMD3100及敲减CXCR4后CXCR4、PARP-1在蛋白及基因水平表达进一步下降。
5、cBioPortal数据分析显示乳腺癌患者组织样本中CXCR4与PARP-1呈共生关系，且二者mRNA的表达呈正相关。
结论:
1、PJ34对MDA-MB231细胞具有增殖抑制作用，且呈时间及浓度依赖性；并能诱导MDA-MB231细胞凋亡。
2、CXCR4抑制剂AMD3100及敲减CXCR4能使PJ34抑制细胞增殖及诱导凋亡的作用增强；其可能原因是使pAKT、Bcl-2、Mcl-1表达下降，从而促进细胞凋亡；同时，PARP-1与CXCR4之间可能存在调节关系。