【摘 要】
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目的:生物体中存在丰富的酶,酶的表达与机体的生理和病理活动直接相关,识别这些酶在活细胞中的定位和表达水平在疾病早期诊断、疗效监测方面具有重要意义。作为生物酶活性检测和成像的有力工具,酶激活荧光探针利用酶促反应的催化作用触发产生荧光,能够在不破坏机体的情况下实现低通量、高灵敏度、实时快速检测。在众多类别的生物活性酶中,ALP（Alkaline hospholipase,碱性磷酸酶）由于参与催化碳水化
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目的:生物体中存在丰富的酶,酶的表达与机体的生理和病理活动直接相关,识别这些酶在活细胞中的定位和表达水平在疾病早期诊断、疗效监测方面具有重要意义。作为生物酶活性检测和成像的有力工具,酶激活荧光探针利用酶促反应的催化作用触发产生荧光,能够在不破坏机体的情况下实现低通量、高灵敏度、实时快速检测。在众多类别的生物活性酶中,ALP（Alkaline hospholipase,碱性磷酸酶）由于参与催化碳水化合物、蛋白质、核酸等磷酸盐底物的去磷酸化过程,其活性异常与糖尿病、骨病、肝功能障碍、前腺癌等多种疾病有关。因此,论文拟以碱性磷酸酶为研究对象,ICT（internal charge transfer）、ESIPT（excited state intramolecular proton transfer）原理为导向,通过在荧光母体表面修饰识别基团构建酶激活荧光探针,用于生物系统中碱性磷酸酶的特异性检测,旨在建立具备灵敏高、选择性佳、生物适用性好的监测生物体内酶活动的新方法。方法:（1）利用有机合成方法将2-2-羟基苯基-苯并噻唑（HBT）进行甲氧基和磷酸基团修饰,制备得到化合物分子MHBT-ALP。采用NMR,Uv-vis等测试方法对化合物的组分组成及光学特性进行表征。利用有无ALP介质的荧光响应对比条件来分析荧光探针的光谱性质。通过荧光强度随ALP浓度变化计算MHBT-ALP对碱性磷酸酶的检测限;根据不同荧光强度的变化情况分析其MHBT-ALP反应动力学;随不同p H值的变化情况确定MHBT-ALP适应检测的生理条件;同时研究了MHBT-ALP在各种竞争反应物中对ALP的选择性。最后,在进行了荧光探针细胞毒性试验确定MHBT-ALP最佳生理浓度后,将其应用于Hela细胞中内源性碱性磷酸酶的检测。（2）采用3-羟基-3-甲基-2-丁酮,4-羟基苯甲醛等药品进行一系列有机化学反应,制备得到化合物TCF-ALP。样品的组分组成及光学特性分别使用NMR,Uv-vis等测试手段进行表征。利用荧光探针在接触碱性磷酸酶前后荧光强度的变化程度来定量检测ALP。随之,我们对探针进行了检测限、反应动力学研究,考察了其在各类干扰物中对的ALP选择性。最后,在TCF-ALP荧光探针细胞毒性分析的基础上,确定酶探针的适用生理条件,并将其应用于活体癌细胞中ALP的生物荧光成像分析。结果:（1）2-2-羟基苯基-苯并噻唑（HBT）是典型的具有ESIPT效应的分子。本研究构建出新型的检测碱性磷酸酶的荧光探针MHBT-ALP,将HBT作为荧光团,使用甲氧基和磷酸基团进行修饰淬灭荧光在碱性磷酸酶的酶促反应催化下,探针分子的磷酸盐基团会发生水解释放出羟基官能团,产生ESIPT效应发射出高于原本50倍的荧光。该探针的检测限为0.25 nmol/L,具有较强的ALP探测灵敏性,其且具有显著的荧光效应,易于捕获。MHBT-ALP可用于实时检测碱性磷酸酶的活性,为碱性磷酸酶的原位追踪提供了新的思路和手段。（2）将具有ICT效应的荧光母体二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃（TCF）进行苯酚化修饰,并磷酸化苯酚,构建了一种新型的检测碱性磷酸酶的小分子探针TCF-ALP。该探针在碱性磷酸酶作用下,水解磷酸盐基团,释放出羟基,探针分子内部发生ICT过程,探针的光学性质发生改变,出现较强荧光发射现象。该探针的比色特性在现场检测和“裸眼”观察中具有明显优势,有望为碱性磷酸酶的检测提供一种无需仪器辅助的颜色变化的简便方法。结论:本文结合分子内电荷转移（ICT）,激发态分子内质子转移（ESIPT）原理设计并制备出了荧光探针MHBT-ALP和TCF-ALP,用于碱性磷酸酶的检测。实验表明,两种荧光探针均表现出了较强灵敏性和良好的选择性,并被成功应用干细胞成像。该方法的建立为活体细胞碱性磷酸酶的高效在线检测及其功能性分析研究提供了新思路及技术手段。
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