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启动子是基因表达调控的重要元件,启动子控制基因在特定的组织、特定的发育阶段以及特定的环境条件下表达。启动子的分离与研究在已成为国内生物学研究热点之一,也是我国基础研究发展的重要方向之一。建立启动子捕获系统为启动子分离和研究提供了手段和前提。
蓝猪耳(ToreniafournieriL.)是一种重要的热带、亚热带观花植物,生长期短,盛花期比较长,而且具备特殊的裸露胚囊,是研究植物花器官发育和授粉受精过程的理想模式植物。因此对蓝猪耳关键基因进行克隆和功能分析具有重要的科研价值。
本文构建了启动子陷阱植物表达载体pHAHCA,优化了根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化体系,研究了根癌农杆菌介导的蓝猪耳遗传转化效率与与蓝猪耳品种、叶片外植体生理状态、再生体系和转化途径等关系,建立了T-DNA(GUS)结构介导的蓝猪耳启动子捕获系统。
得到以下主要结果:1.将质粒载体pCAMBIA1200和pAHC27分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切,连接后转化E.coliDH5a,酶切证实启动子陷阱植物表达载体构建成功,命名为pHAHCA。用质粒冻融法,将pHAHCA转化农杆菌EHA101,PCR检测证实pHAHCA成功转入农杆菌EHA101中,获得工程菌种,命名为pHAHCL。
2.以蓝色花蓝猪耳嫩叶为外植体,在OD0.5pHAHCL菌液中侵染5-10min,25℃,黑暗条件下共培养基(AS200μmol/L)上培养4d。将共培养外植体置于诱导愈伤组织培养基(500mg/LCef,12mg/LHgy)上培养14d,可得抗性愈伤。转入诱芽培养基(400mg/LCef)上培养7d,再转入诱芽培养基(Cef400mg/L,Hyg15mg/L)培养28d可得抗性芽。芽体=0.5CM时,转入生根培养基(Cef400mg/L,Hyg15mg/L)21d,可能抗性植株,转化效率达12.5%。共获得82株抗性植株,经PCR和Southernblot检测,证实为转基因植株。
3.对82株转基因植株进行GUS基因稳定表达分析,12株GUS染色呈蓝色,10株蓝色斑点发生在叶片叶脉部位,2株在发生在叶片叶脉部位和茎。
4.对12株转基因植株进行TAIL-PCR,获得一条T-DNA侧翼序列,与粳稻日本晴染色体1具有同源核苷酸序列,同源性为90%;与拟南芥羧酸酯酶(β-酯酶)具有同源核苷酸序列,同源性为86%,具有同源氨基酸序列,同源性为57%。