论文部分内容阅读
为了研究家蚕表达的重组人促红细胞生成素（rhEPO）口服治疗肾性贫血的疗效并评价安全性，本论文使用Bac-to-Bac系统构建重组人促红细胞生成素家蚕杆状病毒（vBm-rhEPO），并使用实时荧光定量PCR的方法检测重组病毒滴度。经SDS-PAGE和Western Blotting鉴定，家蚕卵巢上皮细胞（BmN cell）、五龄幼虫和蛹分别接种重组病毒vBm-rhEPO发病后，均成功表达rhEPO（BmrhEPO）蛋白，且分子量大小一致，约为25kDa。将接种vBm-rhEPO后发病的蚕蛹匀浆、冻干制成BmrhEPO蚕蛹冻干粉，经ELISA检测，BmrhEPO蚕蛹冻干粉中BmrhEPO蛋白的含量约为8382IU/g。通过分析BmrhEPO对人红系白血病细胞（TF-1cell）生长增殖的促进作用，使用MTT法检测到BmrhEPO具有与rhEPO(中国仓鼠卵巢细胞(CHOcell)表达)相似的体外生物学活性，相同浓度条件下，BmrhEPO的体外生物学活性高于rhEPO（CHO cell），计算得出，BmrhEPO的半数有效浓度EC50值为0.36IU/mL，略低于rhEPO（CHOcell）的EC50值0.39IU/mL。小鼠口服BmrhEPO蚕蛹冻干粉急性毒性实验显示，BmrhEPO蚕蛹冻干粉基本无毒，最大耐受剂量大于147882IU/kg。使用腺嘌呤连续灌胃构建小鼠肾性贫血模型，并通过肾功能和血常规检测鉴定肾性贫血模型是否构建成功。肾性贫血小鼠分别以73958.8、24652.9和14791.8IU/kg三个不同剂量（BmrhEPO蛋白的有效剂量）连续口服BmrhEPO蚕蛹粉，以血液网织红细胞数及百分率作为药效指标，结果显示，三组小鼠的血液网织红细胞数及百分率与阴性对照组相比均有明显升高，并且与口服剂量呈正相关，这表明口服BmrhEPO治疗小鼠肾性贫血有效。本研究为开发重组人促红细胞生成素口服药物提供了实验依据。