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半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatin是一类专性抑制半胱氨酸类蛋白酶活性的蛋白酶,亦可用于抑制鱼糜加工过程中由半胱氨酸类蛋白酶(主要是组织蛋白酶)引起的蛋白降解(又称凝胶劣化)。 基于前期研究结果,本研究首先以木瓜蛋白酶papain,大黄鱼组织蛋白酶LyccathepsinB和L作为目标酶检测了三种Lyccystatin的酸碱稳定性和热稳定性。三种Lyccystatins中,Lyccystatin-1和2的热稳定性总体较差,Lyccystatin-3的稳定性最好,温度变化时其抑制活性变化较平和,且对LyccathepsinB和L的最高抑制活性均出现在40℃左右,与鱼糜加工的温度接近。在不同pH条件下,三种Lyccystatins对papain的抑制活性都比较稳定,Lyccystatin-3对LyccathepsinB和L及Lyccystatin-2对LyccathepsinL的抑制活性均在pH7.0时达到最大值,Lyccystatin-1对LyccathepsinL的抑制活性则在pH9.0时达到最大值。 随后我们将三种Lyccystatin用于新鲜大黄鱼鱼片的处理以及海水杂鱼糜、带鱼/鲢鱼混合鱼糜的加工过程,以衡量Lyccystatin抑制鱼片蛋白降解和鱼糜凝胶劣化的效果。分别用ddH2O、谷氨酰胺转胺酶(TG酶)溶液和Lyccystatin溶液浸泡处理大黄鱼鱼片后,经目测可观察到ddH2O处理组鱼片出现断裂、破碎状态,SDS-PAGE检测发现其肌球蛋白降解严重,而TG酶和Lyccystatin处理组鱼片都保存完好,肌球蛋白完整性亦较好;使用质构仪测定鱼片的剪切力发现:与ddH2O处理组鱼片的剪切力相比,Lyccystatin-1、2、3处理组的剪切力分别增加了2倍、3.3倍、3.6倍。P<0.05时以上各组与ddH2O处理组相比均存在显著性差异。 在鱼糜处理实验中,首先研究了三种Lyccystatin对海水杂鱼糜的凝胶劣化抑制效果。结果表明,与空白对照组的凝胶强度相比,Lyccystatin-1、2和3均可明显抑制鱼糜凝胶劣化,凝胶强度分别达到对照组的1.4倍,1.3倍和1.6倍。随后我们研究了Lyccystatin-1和3对混合鱼糜凝胶劣化的抑制效果。通过对比添加与未添加Lyccystatin的鱼糜凝胶的凝胶强度、TPA(硬度,弹性,咀嚼性)、持水性能、白度以及凝胶中肌球蛋白的含量变化,来评价Lyccystatin的有效性。结果显示:Lyccystatin-3抑制鱼糜凝胶劣化的效果明显优于Lyccystatin-1。添加0.25μg/g的Lyccystatin-3时鱼糜凝胶强度、咀嚼性、硬度、弹性、持水性能和白度分别达到空白对照组的2倍,1.4倍,1.2倍,1倍,1.1倍和1.1倍。SDS-PAGE检测发现,肌球蛋白的含量明显高于对照组。并且当P<0.05,以上指标的变化与空白对照相比均存在显著性差异。 综上所述,三种Lyccystatin都可有效抑制组织蛋白酶在鱼糜加工过程中造成的凝胶劣化现象,其中Lyccystatin-3的抑制效果最好。 确定了Lyccystatin-3的应用效果之后,采用摇瓶培养优化探索了酵母工程菌PichiapastorisSMD1168/Lyccystatin-3的高效表达条件。发现使用BMG+复合维生素+PTM1(富集菌体培养基)/BMM+复合维生素+PTM1(诱导表达重组蛋白培养基)配方,流加甘油溶液1d,饥饿培养0.5d,然后流加甲醇溶液诱导表达5d,Lyccystatin-3表达量可提高1.7倍,为Lyccystatin-3的进一步发酵罐培养表达奠定了基础。