mRNA荧光差异显示筛选食管癌中高表达基因的研究

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食管癌(esophageal carcinoma)是一种常见的消化道恶性肿瘤。我国是世界上食管癌的高发地区之一,每年平均病死者约15万人。目前食管癌的手术切除或放射性治疗或化学治疗尚无显著成效,重要的原因之一就是对食管癌的发病机理不甚清楚。随着分子生物学的迅猛发展,人们已经意识到从分子水平上研究食管癌机理的重要性。目的:本研究应用mRNA荧光差异显示技术筛选食管癌组织中差异表达的基因,初步探讨其在食管癌中的生物学行为。方法:采用mRNA荧光差异显示的方法筛选手术切除的食管癌组织及癌旁组织中差异表达的基因片断;运用RT-PCR(Real-time PCR)技术对荧光差异显示得到的食管癌差异片段进行验证;对其中高表达的差异基因片断进行全长克隆与测序。结果:1、荧光差异显示技术进行FDD-PCR反应,获得有明显差异的条带6个,对这6个差异条带进行PCR二次扩增,其中4个条带获得阳性结果,对阳性条带进行TA克隆和测序得到可信度较高的3个cDNA片段,它们大小在144bp-227bp之间,分别命名为16-0(144bp)、16-2(216bp)和16-3(227bp)。2、荧光定量PCR对这3个片段验证结果表明,它们在癌组织中表达量均明显高于其相对应的癌旁组织。在NCBI中用discontiguous megablast方法进行同源比较,16-0与人类omega蛋白(Igll3)mRNA(accessionnumber NM001013618)3’端高度同源;16-2与人类信号转导和转录激活因子2(STAT2)mRNA(accession number NM005419)3’端高度同源;16-3与人类第10染色体上开放阅读框99(C10orf99,accession number NM207373)高度同源。3、对其中高表达基因片段16-0克隆得到了该基因的全长,序列分析显示,其读码框长为711bp,编码236个氨基酸。结论:mRNA水平上筛选出来的3个cDNA差异片段是食管癌组织中的高表达基因片断。结合其中主要差异基因片段16-0全长的克隆、测序及同源性比较结果,推测16-0(Igll3)可能是与食管癌相关的免疫球蛋白超家族成员,为进一步阐明其在食管癌发生、演化中的相关机制奠定了理论基础。
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