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本文主要分为两个部分：在第一部分中，制备了重组人尿激酶原氨基末端片段(rhATF)和低分子量尿激酶原变体并进行了活性测定；在第二部分中，利用微型蛋白内含子介导了重组人脑钠素(rhBNP)的制备并进行了活性鉴定。
尿激酶原作为特异性的纤溶酶原激活剂，在纤溶系统中起着极其重要的作用，根据其氨基酸序列和功能的不同可划分为三个结构域：表皮生长因子结构域，它参与了与受体的结合；环柄结构域；蛋白水解酶结构域，它具有催化活性位点。尿激酶原氨基末端片段(ATF)是指尿激酶原的N-末端Ser1-Lys135的氨基酸序列，它包含了表皮生长因子结构域和环柄结构域，能够与尿激酶原受体特异性结合，但不能激活纤溶酶原来启动纤溶系统。实验表明，ATF可以通过阻断尿激酶原和其受体的相互作用，影响尿激酶原参与的一系列生理、病理功能。为了进一步研究ATF的生理功能，人们曾通过酶解尿激酶原的方法来生产ATF片段，但此方法难以控制酶解条件，且得率不高。我们尝试利用基因工程手段，探索一个切实可行、经济有效的纯化、生产重组ATF的方案。首先，从人脐带静脉内皮细胞中纯化总RNA，经RT-PCR获得人ATF基因并将其连接至表达载体pET-29a(+)中，以大肠杆菌DH5α为宿主菌筛选阳性克隆，将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，经IPTG诱导后，重组人ATF(rhATF)的表达量占细菌总蛋白的20％，经包涵体洗涤、变复性、CM阳离子交换柱纯化、以及SuperdexG-75分子筛凝胶层析之后，从每升培养液中可获得15mgrhATF，纯度超过95％。活性测定结果表明rhATF能够阻断尿激酶原与U973细胞表面尿激酶原受体的结合，并能抑制尿激酶对纤溶酶原以及纤溶酶对尿激酶原的激活作用。此外，为了研究尿激酶原的氨基酸序列改变对其形成晶体能力的影响，我们初步构建了两个低分子量尿激酶原的变体Gln147-Lys404(Lys158→Thr158，Ile159→Val159)及Gln147-Lys404(deleteThr152-Pro155)。以人尿激酶原cDNA为模板，通过重叠延伸法的方法进行PCR扩增，得到带有NdeI/SacI酶切位点的突变体基因，并将其插入载体pET-29a(+)构建重组表达质粒，以大肠杆菌Rosette为宿主菌用IPTG诱导表达，经包涵体洗涤、变复性、CM阳离子交换柱纯化、以及SuperdexG-75分子筛凝胶层析之后，得到变体蛋白，并对其进行了初步酶活性测定。
蛋白内含子是宿主蛋白中的一段插入序列，能够在蛋白翻译后成熟的自我催化蛋白剪接过程中被准确切除，并将两侧成为蛋白外显子的序列以正常的肽键连接形成有功能的成熟蛋白。蛋白内含子存在一些保守区和高度保守的氨基酸残基，保守残基与蛋白内含子自剪接反应有着很大的关系，将它们突变可阻断蛋白内含子自剪接反应，从而引起C-端或N-端切割，这一特点被应用于基因工程蛋白质的纯化。将目的蛋白基因插入含有蛋白内含子和一个亲和臂肽链(如chitin结合区)基因的质粒载体，将目的蛋白基因同蛋白内含子基因共同表达为前体蛋白，根据chitin结合区与chitin的亲和性，可以直接在亲和层析柱上发生化学拆除反应，然后，通过Chitin柱洗脱，经一步柱层析就可获得纯的目的蛋白。我们将化学合成的人脑钠素(hBNP)基因用PCR扩增后，连接到pTWIN1载体上，诱导表达得到融合于SspDnaB微型蛋白内含子融合的C-端的rhBNP，在蛋白内含子的N-端有一段CBD(chitinbindingdomain)序列。在pH7.0条件下，蛋白内含子介导C-端切割，rhBNP从融合蛋白中释放出来，通过Chitin柱亲和层析分离掉融合蛋白的剩余部分，再经C18反相高效液相层析可得到纯度较高的目的蛋白。体外活性测定结果表明，rhBNP样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应，其ED50为(1.24±0.32)×10-6mg/mL。此外，为了进一步摸索目的蛋白的纯化条件和蛋白内含子的最佳切割条件，我们从上述重组载体获得CBD-SspDnaB-rhBNP的基因，并将其重组到pET-28a(+)中，得到带有组氨酸尾巴的新的融合蛋白，经Ni-Sepharose亲和层析初步纯化后，对pH7.0的缓冲液透析使蛋白内含子发生C-端切割，再用CM阳离子交换柱处理也可得到目的蛋白。