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本研究的目的：在前阶段工作的基础上，以原核表达系统为主，优化表达体系及表达条件，用亲和层析的方法，纯化出可溶形式的目的蛋白。尝试构建杆状病毒表达载体(BAC-TO-BAC)，期望获得溶解性更好、活性更接近于天然状态的目标蛋白质，为下一步的动物免疫工作提供有活性的免疫原。
材料与方法1.构建重组表达载体，依据融合基因gD2-hIL-2全长序列，保留gD2基因的信号肽，设计一对特异性引物，PCR法扩增目的基因。双酶切扩增片段和表达载体，酶切产物连接，连接产物转化入克隆菌株，筛选阳性克隆，抽提质粒，PCR、双酶切和测序鉴定，应用电脑软件，分析融合基因。2.目的蛋白的表达与优化,重组表达质粒转化入工程菌，随机挑选克隆，扩大培养，诱导表达，SDS-PAGE和Westernblot法检测。阳性克隆菌株扩大培养，IPTG诱导，对细胞各组分进行SDS-PAGE分析，判断可溶性。改变温度、IPTG浓度，不同条件下诱导目的蛋白表达，对胞质可溶组分进行SDS-PAGE分析，摸索最佳表达条件。3.目标蛋白质纯化,将单个转化菌扩大培养，以最佳条件诱导表达，收集菌体，超声波裂解，收集上清液。选用His-Bind亲和纯化试剂盒，经结合、漂洗和洗脱等步骤，分离融合蛋白，用特异性蛋白酶将标签切掉，得到纯化的目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot法检测纯化效果。标定最终体积、浓度，保存目的蛋白备用。4.重组杆状病毒表达载体的构建双酶切原核重组体和杆状病毒供体质粒，将融合基因亚克隆入供体质粒，连接产物转化感受态细胞，抽提质粒，双酶切和PCR法鉴定，转化重组供体质粒至DH10BAC-感受态细胞(包含杆粒及辅助质粒)，蓝白斑筛选，靶序列自动转位至BACMID(杆状病)。