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研究目的：
本课题应用不同流感病毒株(H5N1、H3N2、H1N1)，分别在细胞模型和动物模型观察其体内外抗病毒效果，并为抗病毒机制研究提供依据。
研究方法：
(1)体外抗H1N1和H3N2流感病毒作用
本实验采用MDCK细胞培养法进行体外抗流感病毒作用的实验研究，分先感染病毒后加药、先加药后感染病毒两种方法进行研究，药物作梯度稀释，每浓度4个复孔，同时设达菲阳性对照组，病毒对照组和正常细胞对照组。37℃、5％CO2，饱和湿度培养72h，每天用倒置显微镜观察细胞病变(CPE)情况并记录，据CPE实验结果判断药物的作用效果。用Reed-Mueneh法计算药物的半数有效浓度(EC50)。以药物剂量的对数为横坐标，以细胞CPE抑制率为纵坐标绘图。探讨不同给药方式下，其量效关系曲线走势，及药物对流感病毒的抑制作用。
(2)构建流感小鼠模型
分别构建H5N1禽流感、H1N1和H3N2人流感小鼠模型。BALB／e小鼠随机分组，以乙醚轻度麻醉后，分别滴鼻感染H5N1、H1N1和H3N2流感病毒，每只10μl。并按不同的剂量(Statin 50μg/caffeine 200μg或Statin 25μg/caffeine
200μg)，不同的给药方式(滴鼻或灌胃)、不同的处理方式(预防或治疗)，观察药物在小鼠体内的抗流感作用。同时设阳性对照、病毒对照和空白对照。从感染之日起，连续观察14d，观察小鼠的发病症状。
(3)肺组织病理检测
在H3N2和H1N1流感病毒动物实验中，在病毒感染后第5天和14天，每组分别处死5只小鼠；在H5N1流感病毒动物实验中，在病毒感染后第9和13天，每组分别处死5只小鼠。打开胸腔分别取气管及肺脏，肉眼观察记录各组小鼠肺大体病变情况。并按常规方法做组织切片(HE染色)，在光学显微镜观察各组动物肺及气管的病理变化。
(4)荧光定量RT-PCR分析
用TRIZOL法提取肺组织中的RNA，检测样品的A260／280比值在1.8～2.0之间，采用实时荧光定量RT-PCR方法检测小鼠肺内H3N2、H1N1、H5N1流感病毒核酸的量，探讨药物对流感病毒NP基因复制的抑制作用。
研究结果：
(1)体外抗H1N1流感病毒作用
在病毒吸咐前和在病毒吸咐后用药，statin／caffeine在体外均具有抗病毒活性，Caffeine、Statin、statin／caffeine、达菲的半数有效浓度(EC50)分别为45.29／47.46ug／ml、10.39／10.69ug／ml、30.23／30.56ug／ml和53.72／46.29ug／ml。且在不同的给药方式下，其量效关系曲线走势比较接近，说明药物对流感病毒的抑制作用接近。联合用药组statin／caffeine在病毒吸咐前用药的效果优于病毒吸咐后用药。
(2)体外抗H3N2流感病毒作用
在病毒吸咐前和病毒吸咐后用药，statin／caffeine在体外均具有较强的抗H3N2流感病毒的作用。caffeine、Statin、statin／caffeine、达菲的半数有效浓度(EC50)分别为45.72／46.76ug／ml、11.53／11.24ug／ml、30.29／33.50ug／ml和48.36／45.37ug／ml。且抑制H3N2流感病毒致细胞病变的作用都随着药物剂量的增加而增强，随药物浓度增加，其抗病毒活性增强，且联合用药组statin／caffeine在病毒吸咐前用药的效果优于病毒吸咐后用药。
(3)体内抗H5Nl流感病毒作用
H5N1流感动物实验中，statin 50μg／caffeine 200μg预防滴鼻组和达菲200μg治疗灌胃组的肺组织病变程度相近。说明statin／caffeine对H5N1病毒感染引起的肺组织病理改变有一定的抑制作用，与达菲灌胃的效果相似。与达菲200μg治疗滴鼻组(J组)相比，statin 50μg／caffeine 200μg预防滴鼻组(A组)和马抗-IgG预防滴鼻组(G组)的H5特异性病毒核酸量相对较低(P<0.05)，其他组间无差别。结果提示，statin／caffeine能抑制H5N1流感病毒在肺脏的复制，且优于达菲滴鼻的效果，与马抗-IgG预防滴鼻的效果相似。
(4)体内抗H3N2流感病毒作用
H3N2流感动物实验中，与达菲200μg预防滴鼻组(Ⅰ组)相比，statin50μg／caffeine 200μg预防滴鼻(A组)和灌胃组(E组)、利巴韦林200μg预防滴鼻组(G组)和达菲200μg治疗灌胃组(J组)的肺组织病变程度明显减轻(P<0.05)。同时，这些组间肺组织病变程度相近。说明statin／caffeine对H3N2病毒感染引起的肺组织病理改变有一定的抑制作用，且优于达菲滴鼻的效果，与达菲灌胃的效果相似。与statin 50μg／caffeine200μg预防灌胃组(E组)相比，statin 50μg／caffeine 200μg治疗滴鼻组(B组)、statin 25μg/caffeine 200μg预防滴鼻组(C组)和治疗滴鼻组(D组)、病毒唑200μg治疗灌胃组(H组)和达菲200μg预防滴鼻组(Ⅰ组)的H3特异性病毒核酸量相对较高(P<0.05)，其他组间无差别。提示联合应用statin／caffeine能抑制H3N2流感病毒在肺脏的复制，且优于达菲滴鼻和病毒唑治疗灌胃的效果，且联合应用statin／caffeine预防给药的效果优于治疗给药的效果，statm高剂量(50μg)的效果要优于低剂量(25μg)的效果。
(5)体内抗H1N1流感病毒作用
H1N1流感动物实验中，statin 50μg/caffeine 200μg治疗滴鼻组(B组)和预防灌胃组(E组)与利巴韦林200μg预防滴鼻组(G组)和达菲200μg治疗灌胃组(J组)的肺组织病变程度相近，提示联合应用statin／caffeine对H1N1流感病毒感染引起的肺组织病理改变有一定的抑制作用，且与达菲和利巴韦林的效果相似。与利巴韦林200μg预防滴鼻组(G组)和达菲200μg治疗灌胃组(J组)相似，statin 50μg／caffeine200μg治疗滴鼻组(B组)和预防灌胃组(E组)有相对高的Ct均值，说明这些组小鼠体内的H1特异性病毒核酸量相对较低。
结果提示，联合应用statin／caffeine能抑制H1N1病毒在肺脏的复制，且预防和治疗的效果均较好，与利巴韦林和达菲的效果相似。
结论：
1、联合应用statin／caffeine在体外有明显的抗H3N2和H1N1流感病毒作用，其抑制流感病毒致细胞病变的作用随着药物剂量的增加而增强，且呈明显的量效关系，且病毒吸咐前用药的效果优于病毒吸咐后用药。
2、在流感动物实验中，联合应用statin 50μg／caffeine 200μg可预防并缓解H5N1／H3N2／H1N1流感病毒感染的症状，有效抑制肺组织损伤，并抑制病毒在肺内的复制，且效果相当于或优于达菲。在H3N2流感动物实验中，高剂量联合用药(statin50μg／caffeine200μg)的功效要高于低剂量联合用药(statin 25μg／caffeine 200μg)，且联合应用statin／caffeine预防给药的效果优于治疗给药的效果。提示联合应用statin／caffeine可作为预防和治疗H5N1、H3N2和H1N1流感病毒的药物。