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实验背景:以骨髓干细胞为主的细胞移植在心血管疾病中的应用，是近年研究的热点，并取得了一定的成效。90年代后期，利用基因工程、胚胎细胞及骨髓干细胞制造的新一代“生物起搏细胞”，为病窦等心脏起搏、传导系统疾病的治疗开辟了新的途径。从国内外的实验结果来看，自体骨髓间叶细胞诱导分化为具有起搏功能的细胞是比较理想的、可行的“生物起搏器”制造方法。目前干细胞诱导分化的方法，主要有以下几种：1、使用传统诱导剂5-氮杂胞苷。2、使用细胞因子诱导干细胞分化。3、心肌细胞共培养法。4、细胞裂解液。几种方法都能在体外将干细胞诱导为表达心肌细胞的特异性蛋白α-actin、cTnI以及连接蛋白connexin43的心肌样细胞，但各个方法有不足之处。探索干细胞体外诱导的最优方法将是骨髓间充质干细胞制造生物起搏器中亟待解决的关键问题。
本实验通过分离大鼠的BM-MSCs，在体外将5-氮胞苷(5AZA)作为阳性对照，利用心肌细胞分化所必需的干细胞因子(SCF)和肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、窦房结细胞裂解液等诱导方法，使其分化为具有起搏功能的心肌样细胞，并采用起搏细胞的膜蛋白HCN作为筛选标记指标，通过免疫荧光流式细胞仪，从诱导分化后的细胞中分选出表达HCN阳性，并具有潜在起搏功能的细胞，结合膜片钳技术，在细胞电生理方面进一步证实所分选细胞的起搏功能，为干细胞制造生物起搏器提供理论依据。
实验目的:
1、寻求在体外不同诱导条件下，BM-MSCs直接分化为具有起搏功能的心肌样细胞的实验条件，有望从中发现窦房结细胞裂解液是诱导细胞分化为起搏细胞的最优方法和途径；
2、研究不同体外诱导方法下，干细胞分化为起搏细胞的最有效鉴定方法，即HCN的测定和电生理结合的方法；
3、利用细胞分选技术，从分化出的细胞中挑选出较纯的HCN标记的具有起搏能力的细胞，有望使其进入体内发挥生理功能。
实验方法:
1、采用化学诱导剂(5-氮杂胞苷)、细胞因子(EGF+bFGF、HGF、SCF)以及窦房结裂解液几种方法作为体外诱导剂，研究几种方法在体外条件下，诱导骨髓间质干细胞直接分化为具有起搏功能的心肌样细胞的时相、浓度以及条件，并比较诱导分化效能；
2、利用负责起搏细胞超极化激活电流的膜蛋白HCN作为检测起搏细胞的标志，采用免疫荧光技术和流式细胞分选技术，分选出较纯的具有起搏能力的细胞，并且具备起搏细胞的特点，具有调节起搏能力的膜蛋白的表达；
3、使用膜片钳技术，通过检测分选出细胞的起搏电流(If)和动作电位，从细胞的电生理特性方面证实细胞具有起搏效能，从而探讨HCN与If之间的关系和调节机制。
实验结论:
1.本实验在体外条件下进行5AZA、EGF+bFGF、HGF、SCF以及窦房结裂解液五种方法诱导BM-MSCs分化为心脏起搏细胞的研究，证实了五种方法均能在体外将干细胞诱导为表达心肌细胞特异性蛋白的心肌样细胞，从诱导的成功率、细胞活力等方面综合看，5AZA和窦房结裂解液两种方法最佳。
2.本实验研究了所诱导分化的细胞所表达的HCN情况，并结合膜片钳技术进行细胞起搏电流的测定，从蛋白和功能水平证实体外将干细胞诱导为具有起搏功能细胞的可行性，并且HCN作为细胞分选的标志蛋白是很有前景的纯化起搏细胞的方法。
3、根据上述检测手段的结果，5AZA和窦房结裂解液两种方法有更高的具有起搏功能的细胞产率。
4、诱导后细胞HCN表达情况和其产生起搏电流结果一致性好，可以作为检测细胞起搏功能的指标，并极有希望成为体外分选具有起搏功能细胞的重要标志。