论文部分内容阅读
Pax6是眼发育过程中一种重要的转录调控因子，它包括两个DNA结合区域(配对区和同源区)和一个脯氨酸/丝氨酸/苏氨酸(PST)富集区。Pax6基因对脊椎动物眼的结构发育和嗅觉细胞的分化都是必需的。Pax6基因有多种突变体，如人类的Pax6突变可导致多种表型突变，包括无虹膜，Peters异常，常染色体显性角膜炎，以及家族性的视网膜中央凹发育异常。目前检测到的人类Pax6基因PST区的突变就有12种，其中10种都为截断突变。
本实验以花背蟾蜍鳃血循环期胚胎为材料，用RT-PCR法成功克隆得到了花背蟾蜍Pax6 variant基因开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)全序列基因，连接至pMD18-T克隆载体上后，酶切并克隆至pET-28a表达载体，测序后得到构建正确的原核表达载体。将正确的原核表达载体转入Rosetta(DE3)表达宿主菌中，经过表达条件优化后，得到最佳诱导条件为：诱导温度20℃，IPTG浓度0.5 mM。在该条件下大量诱导表达His-Pax6 variant融合蛋白，经His亲和层析柱纯化后，得到融合蛋白His-Pax6 variant。检测蛋白纯度及浓度后，以该蛋白为抗原，免疫昆明品系小鼠制备多克隆抗血清。并利用酶联免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay； ELISA)检测抗血清效价，达到一定浓度后，眼球取血获得小鼠抗花背蟾蜍多克隆抗血清。
利用免疫亲和层析法纯化多克隆抗血清，利用酶联免疫吸附实验检测抗体灵敏性，并用Western Blot法检测抗体的特异性。实验表明纯化后的抗体具有较高特异性。并用3D-PSSM软件对花背蟾蜍Pax6野生型蛋白和Pax6 variant蛋白进行了二级结构预测，结果表明Pax6野生型蛋白和Pax6 variant蛋白具有相似的螺旋/折叠结构比。在Pax6野生型蛋白中，含有3％的β-折叠和25％的α-螺旋结构域，而在Pax6 variant蛋白中，则含有5％的β-折叠和20％的α-螺旋。在PST区Pax6 variant蛋白比Pax6野生型蛋白少了两个α-螺旋元件。Pax6 variant截断蛋白可能因此失去其反式激活功能，成为Pax6野生型蛋白的结合竞争物，从而形成显性负效应(dominant negative effect)。
以上研究结果为进一步阐明花背蟾蜍Pax6 variant基因及其编码的蛋白在花背蟾蜍发育过程中的作用机制奠定了良好基础。