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心脑血管疾病是当前人类健康的第一杀手,已形成严重的社会问题。缺血性脑血管疾病是主要的心脑血管疾病,以缺血性脑卒中为代表,具有高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率的特点,是中老年人的多发病、常见病。
脑缺血后神经元死亡是脑缺血致残、致死的主要原因,发生机制十分复杂。参与脑缺血损伤的分子机制有兴奋性氨基酸的释放、钙离子稳态失衡、自由基的形成、蛋白酶的激活、基因表达的改变等。
近年来,脑内兴奋性氨基酸递质和受体的研究取得重大突破。实验结果表明,正常情况下谷氨酸(Glu)是脑内主要兴奋性神经递质,介导绝大多数兴奋性突触的正常活动,参与可塑性发生机制;谷氨酸过量则导致内源性神经兴奋毒,直接引起神经元溃变死亡,谷氨酸受体过度受刺激是引起神经元死亡的主要病理环节。因此,寻求安全、有效的谷氨酸受体拮抗剂,成为当前脑血管疾病的研究的前沿之一。
α-环丙氨酸(1-aminocyclopropanecarboxylicacid,ACC/ACPC),广泛存在于天然植物中,具有脑神经保护、抗惊厥、抗癫痫等药理作用。本研究采用条件温和的绿色新方法合成ACC,并分别用离体试验和整体试验探索ACC对谷氨酸兴奋毒的拮抗作用和对缺血性脑损伤的保护作用。
1.离体试验大鼠小脑颗粒神经元的凋亡试验:采用原代培养的大鼠小脑颗粒神经元建立离体的谷氨酸神经毒性模型,采用二乙酸荧光素(FDA)和Hoechst33258DNA染色法,观察神经元存活率及形态学特征,用琼脂糖凝胶电泳分析神经元死亡的生化特征。结果显示,ACC能抑制谷氨酸诱导的神经元凋亡,使小脑颗粒神经元的存活率明显提高;使200μmol/L谷氨酸引起的细胞核固缩、凝聚和断裂现象消失;谷氨酸使神经元的DNA电泳图谱出现明显的“梯子状”,ACC使此现象消失。
2.整体试验小鼠急性脑缺血试验:采用小鼠断颅法,观察ACC对急性完全脑缺血后喘息时间的影响,结果发现ACC100,200,400mg/kg剂量组的喘息时间都比正常组显著延长,张口次数也明显增加。
小鼠急性不完全脑缺血试验:采用小鼠双侧颈总动脉合并迷走神经结扎法,观察ACC对急性不完全脑缺血后存活时间的影响,结果ACC100,200,400mg/kg剂量组的存活时间都比正常组显著延长。
小鼠局灶脑缺血试验:采用线栓技术阻塞大脑中动脉诱导ICR小鼠持续性局灶脑缺血,于缺血后6h、24h进行神经症状评分,并于24h后取脑,测定脑指数,再进行冠状切片,TTC染色,以图像处理软件计算脑片梗死面积,并以梗死体积评价脑梗死程度。结果ACC100,200,400mg/kg都能改善神经症状、降低脑指数和明显缩小梗死体积。