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目的:新生儿缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic ischemic brain damage，HIBD)是新生儿神经功能障碍和严重伤残的高危因素。新生儿HIBD在我国是高发疾病之一，发病率高达2％～9％，其中一部分患儿还会产生严重的神经系统后遗症，对社会和家庭造成极大的经济和精神损失。HIBD分为急性期，亚急性期以及慢性期。急性期主要表现为大量的神经元凋亡，亚急性期主要表现为线粒体损伤、兴奋毒性和炎症等。慢性期为慢性炎症并伴随血管增生、脑损伤修复等。在临床上，亚低温普遍应用的温度是33～34℃。亚低温治疗能够缩小大鼠的梗死灶面积，但并不能改善神经功能评分。钙蛋白酶(calpain)分为μ-calpain和m-calpain。μ-calpain执行的是正常生理功能，m-calpain发挥与钙超载相关的病理作用。HET0016是20-羟基二十碳四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）的抑制剂，能够抑制20-HETE造成的HIBD，具有神经保护作用。因此为了进一步提高亚低温对HIBD的治疗效果，本课题组应用药理学以及分子生物学等方法，研究海马神经元氧糖剥夺模型，探讨HET0016联合亚低温对HIBD的保护作用，同时研究HET0016对HIBD的治疗机制。 研究方法:采用健康新生SD大鼠，原代培养海马神经元，培养7天后，将处理组的培养液弃掉，换成无糖Earles液(Earles balanced salt solution，EBSS)，在1％ O2中培养2h，之后更换为正常培养液在CO2培养箱中恢复氧供应，同时加入HET0016，分别在3h、6h、8h后放入34℃培养箱培养24小时。随机将其分为对照组;氧糖剥夺2h组;同时设置氧糖剥夺1h的对照组;氧糖剥夺/复氧组;复氧后进行亚低温处理组，将其分为三个亚组:分别在复氧复糖3h、6h、8h后进行亚低温处理;氧糖剥夺/复氧后，HET0016联合亚低温处理，在复氧同时加入1μM HET0016，将其分为三个亚组，处理同上。MTT法检测神经元存活率，共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度，免疫印迹法检测m-calpain表达水平，流式细胞仪检测海马神经元凋亡率等。 结果:1、氧糖剥夺降低海马神经元存活率。与C组相比，氧糖剥夺(Oxygenglucose deprivation，OGD)2h组的神经元存活率明显降低，存活数量减少，细胞贴壁能力减弱，折光性差，胞体变圆，甚至裂解(P＜0.01)，而OGD1h组与C组比没有显著差异;与OGD2h组比较，O/R-M、O/R-M-H组的海马神经元相对存活率升高，存活数量增多(P＜0.05)，且O/R-M-H组存活率更高（P＜0.01）。 2、氧糖剥夺增加细胞内钙离子浓度。共聚焦显微镜检测氧糖剥夺后各组的神经元钙离子浓度，与正常对照组相比，氧糖剥夺的海马神经元钙离子荧光强度明显增加（P＜0.01）;联合药物HET0016及亚低温处理后，神经元钙离子荧光强度减弱(P＜0.05);3h后进行亚低温处理的海马神经元钙离子荧光强度低于6h、8h后进行处理的海马神经元(P＜0.01);同时HET0016联合亚低温处理的海马神经元钙离子荧光强度比单独亚低温处理的钙离子荧光强度减弱(P＜0.05)。 3、氧糖剥夺后神经元m-calpain蛋白表达水平明显升高。与正常对照组相比，氧糖剥夺组海马神经元m-calpain蛋白表达水平升高(P＜0.01);联合药物HET0016及亚低温处理后，m-calpain蛋白表达水平降低(P＜0.05);氧糖剥夺3h后进行亚低温处理的海马神经元m-calpain蛋白表达水平低于6h、8h后进行处理的海马神经元m-calpain蛋白表达水平（P＜0.01）;同时HET0016联合亚低温处理的海马神经元m-calpain蛋白表达水平比单独亚低温处理的海马神经元m-calpain蛋白表达水平低（P＜0.05）。 4、静默神经元m-calpain，神经元凋亡率降低。与正常组比较，氧糖剥夺组的神经元凋亡率显著升高(P＜0.01);单独亚低温处理的神经元凋亡率下降，且亚低温联合药物HET0016处理的神经元凋亡率比单独亚低温处理的神经元凋亡率低(P＜0.05);与未转染组相比，转染组的神经元凋亡率显著降低(P＜0.05)，说明m-calpain参与了氧糖剥夺后海马神经元的凋亡发生过程。 结论:1、氧糖剥夺能够造成钙超载、钙蛋白酶表达增加，钙离子大量释放到细胞浆中，诱发神经元凋亡。2、HET0016能够降低m-calpain的表达水平，抑制氧糖剥夺海马神经元的凋亡级联反应，m-calpain参与了氧糖剥夺海马神经元的凋亡发生过程。3、20-HETE抑制剂HET0016可以明显增加亚低温对氧糖剥夺的治疗效果。4、HET0016联合亚低温治疗新生儿HIBD的效果越早越好。