【摘 要】
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兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种高传染性,高致死性的急性烈性传染病,给养兔业和
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兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种高传染性,高致死性的急性烈性传染病,给养兔业和相关行业带来了巨大的经济损失。RHDV属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus),为单股正链RNA病毒,含有1条约7.4 kb的基因组和1条约2.2 kb的亚基因组。VP60是RHDV的主要结构蛋白,是病毒的免疫保护性抗原,是RHD诊断和疫苗研发的重要分子。RHD无有效的治疗手段,目前控制的主要措施为疫苗免疫预防。为了更好地控制和预防兔出血症,本论文从RHDV的检测和RHD基因工程疫苗的免疫保护机制两方面进行研究。根据VP60蛋白基因序列设计引物建立兔出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法,利用该方法对不同时间点不同样品中病毒含量的动态变化进行分析;另外从体液免疫应答和细胞免疫应答两方面评估兔出血症基因工程疫苗的免疫保护机制。主要研究内容如下:1.兔出血症病毒SYBR Green RT-PCR检测方法的建立及应用根据兔出血症病毒的VP60蛋白基因序列设计引物,经过反应体系和反应条件的摸索和优化,建立了重复性好、敏感性强的RHDV SYBR Green RT-PCR检测方法,可有效检出重组质粒为14.6拷贝/μL的样品。利用该方法对RHDV感染兔6h、12h、24 h、30 h、36 h的血清、肝、脾中的病毒含量动态变化进行检测。结果表明,血清、肝、脾三种样品中病毒含量均呈现时间依赖效应,随着时间增加,其病毒含量呈现几何数增长。家兔感染RHDV12h、24h、30h及36h后,血清中病毒含量分别达到约105、106、107、108拷贝数;肝脏中病毒分别达到约105、108、108、109拷贝数;脾脏中病毒含量分别达到约105、108、108、108拷贝数左右;肝脏中的RHDV含量最高,说明肝脏是其主要的靶组织。2.兔出血症基因工程疫苗免疫保护机制的研究为研究兔出血症基因工程疫苗的免疫保护机制,以兔出血症基因工程疫苗免疫健康易感家兔,同时设立组织灭活疫苗免疫组和PBS空白对照组,从体液免疫应答和细胞免疫应答两个方面评估疫苗的免疫效力。分别在免疫接种后0、3、7、14、21、28 d采集各组兔血液,通过ELISA方法检测血清中RHDV特异性抗体IgG和IgM水平以及细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)的水平变化;用血凝抑制(HI)检测血液中总抗体的水平变化,于21 d对所有试验动物攻毒,以攻毒保护试验评估疫苗的免疫保护能力。试验结果表明,免疫后7天、14天和21天,组织灭活疫苗组和基因工程疫苗组血清中特异性抗体IgG、IgM均显著升高,与对照组相比差异显著(P<0.05);基因工程疫苗组与对照组相比,免疫后3天、7天和14天血清中IL-2、IL-4和IFN-y含量均显著(P<0.05)增高,组织灭活疫苗组与对照组相比,血清IL-2含量无显著(P>0.05)差异,IL-4和IFN-y含量显著(P<0.05)升高;与对照组相比,免疫后7天、14天、21天两组疫苗组血清的血凝抑制效价均显著升高(P<0.05);同时还发现,基因工程疫苗组诱导产生的特异性抗体(IgG、IgM)、细胞因子(IL-4、IFN-γ)均比组织灭活苗组高,且免疫后3天、7天、14天、21天以及28天基因工程疫苗组血清中IL-2显著(P<0.05)高于组织灭活苗组;攻毒保护试验结果显示,两种疫苗均能100%保护RHDV的攻击。因此,兔出血症基因工程疫苗可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫应答反应,有效预防兔出血症。
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