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川西高原因海拔高,地形复杂,高寒缺氧,紫外线较强等独特的地理环境和气候条件使该地区具有独特的微生物资源。本研究以采集至川西高原自然发酵的牦牛奶和牧场环境中采集的土壤,青贮等样品中分离的乳酸菌作为研究对象,对分离出的乳酸菌进行分类鉴定。并以筛选制作饲料稻青贮用乳酸菌为目的,从产酸,耐酸,耐高温,抗菌活性四个方面对分离出的乳酸菌进行筛选,然后将筛选出的优势乳酸菌用于小规模青贮用饲料稻的制作和分析。
本实验联合基因分类技术16SrDNAPCR-RFLP和BOX-PCR将86株供试菌株分为了主要的10个类群。从每个群中选取一到两株乳酸菌进行了16S rDNA序列分析,并构建了系统发育树。从系统发育树可以看出,供试菌株主要分布于4个类群,它们分别为Enterococcus durans/hirae,Lactobacillus plantarum/ppeyltosus,L.fermentum和L.Paracasei,其分离率分别为38.4％,18.6％,16.3％和9.3％。从不同生境中分离的微生物情况来看,不同的生境微生物的种类差异较明显。自然发酵的酸奶中的乳酸菌主要为E.durans/hirae,L.fermentum,和L.paracasei。在牧场环境中分离的乳酸菌多样性较强,除了主要包含L.plantarum/pentosus外,E.durans,E.faecium,L.brevis,L.bucheri,Lactococcus.lactic spp lactics和La.garvieae也都有被分离。
从16S rDNA序列构建的系统发育树来看,E.durans/hirae,L.plantarum/pentosus没能鉴定到种的水平。atpA基因被用来分析E.durans类群菌株。以肠球菌atpA基因序列为基础构建的系统发育中三株代表性菌株SCA2,SCA16和SCA17与Edurans清楚的聚到一起,在序列相似性上他们与E.durans的atpA基因序列相似度大于99.9％,而与16S rDNA序列相似度较高的种Ehirae的相似度都小于91％,因此atpa基因分析将三株肠球菌菌株SCA2,SCA16和SCA17准确的鉴定为E.durans。API50 CH试验被用来对L.plantarum类群的菌株进行准确鉴定,结果证实,SCA7,SCA39和NR1-2与标准菌株L.plantarum(JCM1149T)具有相同的糖发酵模式,而与L.pentosus(JCMl558T)发酵模式存在较大的差异,因此该类群菌株被鉴定为L.plantarum。
为了筛选发酵饲料稻青贮用发酵剂,所有供试菌株被用于测试其产酸速率,耐酸能力,耐高温能力,以及对腐败或是有害菌的拮抗能力。产酸能力强,能耐受pH2.0的酸性环境,在45℃条件下生长良好的5株植物乳酸菌NT1-1,NR1-2,NQ1-2,NQ2-1,SCA7被选出作为青贮饲料稻发酵的菌株。由于SCA52(L.fermenlum)具有较好的抑菌效果,因此也被筛选用于青贮饲料稻的发酵研究。其他不同种的四株菌株SCA35(L.buchneri),SCA34(L.paracasei),SCA6(E.durans)和NN2-2(L.brevis)也被同时用于对比分析不同种属乳酸菌在发酵饲料稻中的发酵特性。
室温条件下发酵30天和60天的青贮样品被用于饲料稻的品质分析。本实验对比自然发酵(未接种乳酸菌)的饲料稻青贮,主要从饲料稻的外观,发酵品质,微生物变化,化学成分变化四个方面,对接种乳酸菌发酵的饲料稻青贮进行了分析。从感官分析的结果来看,不同的菌株在感官品质上差异较显著。5株L.plantarum、SCA52以及NN2-2得分较高,表现出良好的感官品质。而菌株SCA35,SCA34和SCA6接种发酵青贮后在感官品质上与对照差异不明显。从接种不同的乳酸菌对饲料稻青贮的微生物组成的影响来看:接种不同的乳酸菌对好氧细菌的数量影响较大,NR1-2发酵的青贮样品中好氧菌的含量最少,与对照相比降低了4个数量级;菌株NQ2-1和NQ1-2表现出了极好的抑制霉菌生长的能力,在发酵30天的样品中未检测到霉菌;对大肠杆菌的抑制效果来看,菌株NR1-2,NQ2-1和NQ1-2三株菌株能有效降低大肠杆菌的数量。从不同的发酵时间来看,发酵60天的样品与30天样品相比:好氧细菌数目均有所下降,而在霉菌的数量上,除了SCA35,所有的样品包括对照,生长都受到抑制。而样品中的大肠杆菌含量,除了SCA35,SCA6和对照还具有一定数量的数目,其他的样品都未检测到。在发酵60天的青贮样品中,抑菌效果最好的菌株为SCA52:样品中检测到的芽孢杆菌数是所有样品中最低的,而且丁酸菌,霉菌,酵母菌以及大肠杆菌均未检出。因此该菌非常适合用于接种青贮饲料的混合发酵研究。从青贮饲料的发酵品质来看:5株L.plantarum和NN2-2(L.brevis)发酵的青贮得到了满分,证明这几株菌在改善饲料稻发酵品质上起到了很好的效果,因此适用于饲料稻青贮的制作。从乳酸菌对饲料稻化学成分的影响来看,不同样品在干物质,酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维的含量以及糖分含量的变化上差异较显著(P＜0.05),而在粗脂肪,粗蛋白的变化上差异不显著。
因此从全面的评估结果来看,菌株NR1-2,NQ2-1和NQ1-2发酵全株饲料稻青贮后,与对照相比青贮品质得到改善,有害微生物数量明显减少,适用于大规模青贮用饲料稻的发酵研究。菌株SCA52虽然产酸能力不强,但因具有较好的抑菌能力,因此适合用于饲料稻的混合发酵实验。