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本研究以镰刀属真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)为靶标,以其抗真菌结合诱导禾谷镰刀菌(F.graminearum)的分生孢子形成厚垣孢子为活性筛选模型,从不同的土壤中分离筛选诱导厚垣孢子形成的活性细菌。选取其中一株活性稳定且较强的细菌,进行菌种鉴定。分离纯化该菌株代谢产物中诱导厚垣孢子形成的活性化合物,进行结构鉴定。针对该化合物对一系列真菌的分生孢子形成厚垣孢子的诱导进行研究,发现该化合物还能诱导捕食线虫真菌形成捕食器官。此外,本研究还针对细菌、真菌、线虫三者之间的关系进行初步探索。总结实验结果如下:
1.采集土样,分离到376株细菌,以禾谷镰刀菌(F.graminearum)为靶标,用抗真菌结合诱导形成厚垣孢子为活性筛选模型,从中筛选到10株细菌,发现其代谢产物能诱导禾谷镰刀菌(F.graminearum)形成厚垣孢子。这10株细菌均为杆菌,其中3株革兰氏阳性菌,7株革兰氏阴性菌。
2.选取其中一株活性稳定且较强的细菌,菌种鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),发酵培养该菌株,以禾谷镰刀菌(F.graminearum)为靶标,用抗真菌和诱导厚垣孢子形成为活性追踪模型,将获得的发酵产物通过有机溶剂萃取、凝胶层析、硅胶层析、HPLC等分离方法,纯化得到活性化合物9mg。
3.活性化合物通过碳谱、氢谱、HMBC、FAB+等图谱数据,确认其结构为环肽抗生素IturinA-2,分子量为1043,分子式为C48H75N12O14。
4.该活性化合物可以诱导一系列真菌的分生孢子形成厚垣孢子,其中包括文献报道产厚垣孢子的真菌和不产厚垣孢子的真菌。用扫描电镜和透射电镜对活性化合物诱导禾谷镰刀菌(F.graminearum)形成的的厚垣孢子进行研究,结果表明其具有典型的双层壁结构。同时发现该化合物在诱导捕食线虫真菌少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)与椭圆单顶孢(Monacrosporium eUipsosporum)的分生孢子形成厚垣孢子的同时,还形成大量的捕食器官——三维菌网以及粘球。
5.针对细菌、真菌与线虫三者之间的关系,分别设计平板和土壤实验,初步结果显示,三者共存的情况下,细菌加速促进真菌捕食器官的产生,进而提高捕食线虫效率。
本论文的创新性体现为:
1.首次建立以禾谷镰刀菌(F.graminearum)为靶标,以抗真菌结合诱导形成厚垣孢子为活性筛选标准的生物模型;首先用抗真菌模型确定细菌发酵液中的抗真菌活性馏分,再用诱导厚垣孢子形成的方法确定抗真菌馏分中存在诱导厚垣孢子形成的部分,以保证代谢物中的活性化合物在分离过程中不会丢失。 2.首次分离得到诱导厚垣孢子形成的活性化合物,并进行结构鉴定。
3.首次发现该活性化合物诱导捕食线虫真菌少孢节丛孢(A.oligospora)与椭圆单顶孢(M.ellipsosporum)的分生孢子形成厚垣孢子的同时,还诱导形成大量的捕食器官——三维菌网或粘球。