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干旱,盐渍是制约农业发展,造成环境恶化的重要因素。随着对植物抗逆分子机制研究的不断深入及转基因技术的日趋完善,获得更多的抗逆基因,以分子育种技术培育高效抗逆植物新品种,是解决这一问题的关键。
lea(lateembroygenesisabundant)基因是一类抗逆相关基因。Lea基因通常是在植物种子发育晚期中大量表达,也可受干旱、盐、低温等胁迫诱导表达。LEA蛋白的表达与植物细胞抗逆保护作用有着密切的关系。
LEA3蛋白序列中通常含有高保守的11氨基酸重复序列(TAQAAKEKAGE),拷贝数从几个到十几个不等。11氨基酸重复序列的高保守性,暗示了该结构可能是LEA3蛋白重要功能结构域。
为研究11氨基酸重复序列的耐盐功能及其与结构的关系,首先构建PM2蛋白(LEA3)及其缺失克隆,即重组菌BL21/PM2(全长序列)、BL21/PM2D(含6拷贝11氨基酸基元序列)和BL21/PM2E(含12拷贝11氨基酸基元序列)。经SDS-PAGE电泳检测,重组菌可被诱导表达目的蛋白,其分子量分别为50kDa、15kDa和26kDa。三种重组蛋白均具有良好的亲水性和热稳定性。
点板实验表明,PM2、PM2D和PM2E多肽的过量表达对大肠杆菌的生长无抑制作用。
经将三种重组菌在高NaCl和高KCl培养基上的存活率比较,可知在500mMNaCl和500mMKCl胁迫下,BL21/PM2菌的存活率明显高于BL21/pET28菌;BL21/PM2D菌的存活率可达BL21/PM2菌的70%;BL/21PM2E菌的存活率则为BL/PM2D的2倍。由此证明PM2蛋白和11氨基酸重复序列可提高大肠杆菌耐盐力,11氨基酸重复序列是PM2蛋白的一个耐盐结构域。11氨基酸序列的加长与蛋白耐盐功能呈正相关。在含1200mM山梨糖的固体培养基上,四种重组菌的存活率无明显差异。
采用圆二色谱(circulardichroism,CD)技术研究在水溶液中11氨基酸重复序列二级结构的变化。结果表明PM2D和PM2E重组蛋白在水溶液中均为随机卷曲状态。在一定范围内,SDS或TFE能诱导重组蛋白出现α-螺旋。随着SDS和TFE浓度的升高,PM2D和PM2E重组蛋白的α-螺旋的比例升高。PM2D和PM2E重组蛋白的α-螺旋含量可达到59.3%和74.7%。而溶液pH值的变化(1~10)和加入蔗糖均不能诱导重组蛋白的二级结构改变。
综合以上实验结果,可以推测,PM2、PM2D和PM2E重组蛋白中高比例的α-螺旋的形成可能是LEA蛋白参与耐盐保护作用的重要结构基础。