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背景: 近年来由中草药诱导肝损伤的报道日益增多，其中就包括了黄药子诱导的肝毒性。黄药子(Airpotatoyam)是薯蓣科藤本植物黄独(Dioscorea bulbifera L.)的块茎，临床上主要用于甲状腺疾病以及肝癌、乳腺癌等多种肿瘤的治疗。实验室前期的研究表明，黄药子可以诱导显著的急性肝损伤，其所含的黄独素B是主要的肝毒性成分。但是目前黄药子肝毒性的机制尚不是很清楚，也并未寻找到可以快速、灵敏的检测其肝毒性的生物标志物。 microRNA(miRNA)是一类长度在18-24个核苷酸的内源性非编码小分子。由于miRNA在生物体内的稳定性和便于检测，随着快速、高通量的miRNA芯片检测技术的发展，为它作为肝毒性生物标志物提供了可能。miRNA也是具有转录后基因调控功能的小分子RNA，随着miRBase等数据库的日益完善，为其调控的下游靶信号分子的研究提供了有力支撑。 目的: 本论文主要在实验室前期对黄药子肝毒性研究的基础上，基于miRNA寻找可以指征黄药子肝毒性的血清生物标志物，并从miRNA及其调控下游信号通路的角度揭示黄药子及其主要肝毒性物质黄独素B诱导肝毒性的机制，为临床上黄药子的安全使用提供实验依据。 方法: 1.ICR或C57BL/6小鼠单次给药黄药子乙酸乙酯提取物(Ethyl acetate fraction ofAirpotatoyam，EF)(450 mg/kg)或黄独素B(Diosbulbin B，DB)(300 mg/kg)，给药24 h后取血、取肝组织。检测小鼠血清中谷丙转氨酶(alaninetransaminase，ALT)、谷革转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)酶的活力，分析药物诱导的急性肝损伤。 2.利用miRNA基因芯片检测动物血清中miRNA的变化情况，并通过Realtime-PCR实验进一步验证miRNA的变化，得到候选的血清miRNA生物标志物。 3.C57BL/6小鼠单次给药对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)(300 mg/kg)、野百合碱(Monocrotaline，MCT)(360 mg/kg)、川楝素(Toosendanin，TSN)(300mg/kg)，给药24h后取血，检测血清ALT/AST酶活性来指征肝毒性;Realtime-PCR实验检测候选的miRNA在APAP，MCT，TSN给药诱导急性肝毒性小鼠血清中的变化情况，进一步验证候选血清miRNA生物标志物的特异性。 4.利用miRNA基因芯片检测动物肝组织中miRNA的变化情况，并运用Realtime-PCR实验进一步验证miRNA的变化，发现在黄药子或DB诱导的肝毒性中发挥重要作用的候选miRNA。 5.通过miRNA靶基因预测数据库对候选miRNA进行靶基因的预测，靶基因的交集在DAVID数据库中分析信号通路。在肝组织上通过Real time-PCR、蛋白电泳实验进一步验证筛选到的备选靶基因。 6.在人正常肝L-02/CYP3A4细胞上，采用MTT(3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide)实验检测DB诱导的肝细胞毒性。 7.在人正常肝L-02/CYP3A4细胞上，通过流式细胞分析实验检测DB对细胞周期变化的影响。 8.在人正常肝L-02/CYP3A4细胞上，采用Real time-PCR、蛋白电泳实验进一步在细胞上验证筛选到的候选miRNA和备选靶基因。 9.在人正常肝L-02/CYP3A4细胞上转染候选miRNA(miR-186-3p，miR-378a-5p)的mimics或inhibitor，先通过Real time-PCR实验验证mimics与inhibitor的可靠性，再通过蛋白电泳实验来验证DB诱导备选靶基因Cdk1的蛋白表达，以期验证Cdk1的确是miR-186-3p，miR-378a-5p的靶基因。 结果 1.黄药子乙酸乙酯提取物(EF)(450 mg/kg)与黄独素B(DB)(300 mg/kg)都能明显升高小鼠血清中ALT与AST酶的活力。 2.EF给药后，通过miRNA基因芯片筛选出显著升高或下降变化超过10倍的miRNA，总共28个;接下来采用Real time-PCR实验验证，发现其中6个miRNA包括miR-5099，miR-702-3p，miR-3076-3p，miR-122-3p，miR-194-5p,miR-3074-1-3p的变化与基因芯片的结果一致。DB给药后，通过miRNA基因芯片筛选出显著升高或下降变化超过10倍的miRNA为37个;进一步采用Real time-PCR实验验证，发现其中14个miRNA包括miR-3094-5p，miR-802-5p,miR-132-5p,miR-1963,miR-1902,miR-5136,miR-5620-5p,miR-365-1-5p，miR-125b-2-3p，miR-3110-3p，miR-667-5p，miR-122-3p,miR-194-5p，miR-5099的变化与基因芯片的结果一致。综合分析发现miR-5099，miR-122-3p，miR-194-5p在EF和DB给药的小鼠血清中均发生了明显变化，可以作为指征黄药子肝毒性的候选血清生物标志物。 3.APAP(300 mg/kg)，MCT(360 mg/kg)或TSN(300 mg/kg)给药小鼠都能明显升高小鼠血清中的ALT与AST酶活力，说明APAP，MCT，TSN均可以明显诱导肝毒性;而上述3个候选miRNA生物标志物中只有miR-5099在这三种物质诱导的小鼠肝毒性的血清中都没有发生明显变化，提示miR-5099是指征黄药子肝毒性的特异性血清生物标志物。 4.ICR小鼠单次给药EF(450 mg/kg)后，肝组织miRNA基因芯片筛选发现显著升高或下降变化超过2倍的miRNA有17个;Real-time PCR实验进一步验证发现其中miR-200a-3p，miR-5132-5p和miR-5130这3个miRNA的变化与基因芯片的结果一致，可以作为参与调控EF肝毒性候选的miRNA。 5.针对EF诱导的肝毒性，通过靶基因预测最终挑选出至少受miR-200a-3p，miR-5132-5p和miR-5130中2个miRNA共同调控的靶基因共7个，包括Mecp2，Iffo2，Pitpnc1，Hmg20a，Rnf165，Mn1和Dnaja1;KEGG信号通路富集分析得到一条内质网蛋白应激通路及其关键的靶基因Dnaja1，它是miR-200a-3p与miR-5130的共同靶基因;进一步采用蛋白电泳、Real-time PCR实验验证发现Dnaja1在EF单次给药小鼠肝组织中表达上调，可能主要是受到了表达下调miR-5130的调控。 6.ICR小鼠单次给药DB(300 mg/kg)后，肝组织miRNA基因芯片筛选发现显著升高或下降变化超过5倍的miRNA有23个。Real-time PCR实验进一步验证发现了其中miR-667-3p，miR-186-3p，miR-2137，miR-770-5p，miR-302c-3p，miR-96-5p，miR-378a-5p这7个miRNA的变化与基因芯片的结果一致，可以作为参与调控DB肝毒性候选的miRNA。 7.DB(50，100μM)与肝细胞L-02/CYP3A4孵育48 h后能够显著降低细胞的存活率。同时Real-time PCR实验结果表明，DB与L-02/CYP3A4肝细胞孵育48 h后明显降低了以上7个候选miRNA的表达。 8.在人正常肝L-02/CYP3A4细胞上通过流式细胞分析实验，检测了不同浓度与不同时间的DB对细胞周期变化的影响，发现DB能使G0-G1期占比例下降，而G2-M期上升，提示DB将细胞阻滞于G2-M期。 9.将上述7个候选miRNA在细胞周期家族中进行靶基因预测，筛选出Cdk1，它是miR-378a-5p和miR-186-3p共同调控的靶基因。蛋白电泳、Real-time PCR实验结果表明，备选靶基因Cdk1在DB给药的肝组织和肝细胞上的表达均明显下降。 10.在人正常肝L-02/CYP3A4细胞上转染miR-186-3p或miR-378a-5p的mimics或inhibitor。Real-time PCR的实验结果验证了mimics可以造成该miRNA过表达，而inhibitor确实能抑制该miRNA的表达。蛋白电泳实验结果发现，miR-186-3p和miR-378a-5p的mimics均能使备选靶基因Cdk1的表达下降，并进一步减少DB诱导降低的Cdk1蛋白;而miR-186-3p或miR-378a-5p的inhibitor则能使DB降低的Cdk1表达逆转升高。 结论 1.通过研究发现miR-5099可以作为指征黄药子诱导急性肝毒性的特异性血清生物标志物。 2.miR-200a-3p，miR-5132-5p和miR-5130及其调控的内质网蛋白应激通路，以及靶基因Dnaja1可能在EF诱导的急性肝毒性中发挥了重要的调控作用。 3.DB可以诱导细胞周期阻滞在G2-M期，miR-186-3p和miR-378a-5p及其调控的下游细胞周期调控分子Cdk1在DB诱导的肝细胞周期阻滞中发挥了重要作用。