海马神经元谷氨酸能和GABA能突触囊泡不同特性及其机制研究

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突触囊泡的产生、储存、释放、回收及循环再利用的动力学过程和特性是突触执行传递功能的重要因素,在神经科学领域中受到广泛重视。有关突触囊泡的释放及循环再利用的模式的假说包括非完全融合的囊泡释放和循环(kiss-and-run)、完全融合(Full fusion)后由Clathrin介导的单元囊泡(Quantalsize vesicle)的内吞及其再循环和活动依赖大囊泡内吞(activity dependent bulkendocytosis,ADBE)等。虽然大量研究为这些不同模式的存在提供了一些证据,但突触囊泡的循环究竟以哪种模式为主仍存在较大争议,各种模式与突触传递特征的关联也不清楚:这些模式可能是不同类型的突触各自具有的不同特性,也可能是同一突触在不同的功能状态下具有不同性质。  谷氨酸能和GABA能神经元分别是中枢神经系统中最重要的兴奋性和抑制性神经元,但这两类突触囊泡循环过程的差异及其机制和意义未得到系统的比较研究。本研究使用电生理、活细胞成像以及电镜技术研究比较两种突触囊泡循环过程的差异。通过比较谷氨酸能和GABA能突触反应短时程可塑性,我们发现两种突触囊泡的即刻释放池(Readily Release Pool,RRP)的清空水平(depletion)和恢复能力都存在显著差异,谷氨酸能突触的RRP不易清空且在很短的时间(200毫秒)内可以恢复,而GABA能突触的RRP具有快速清空和缓慢恢复(秒级)的特点。为解决以往研究突触囊泡释放动力学时很难将两种突触区分比较的问题,我们首次在微岛培养GAD67-EGFPKnock-In小鼠海马神经元上进行了FM标记突触囊泡的实验并且确认了这种实验系统的可靠性,实现了对两种突触囊泡释放动力学的分别观察,发现GABA能回收囊泡比谷氨酸能回收囊泡更快地补充到RRP并更快速完全地释放。这个看似与电生理实验矛盾的结果在我们后续的电镜实验中得到了解释。我们利用扫描透射电子显微镜电子断层扫描三维重构新技术(ScanningTransmission Electron Microscopy Electron Tomography, STEM-ET)对海马组织突触进行立体旋转扫描,对两种类型突触终末超微结构进行观察。我们对近万个囊泡进行了三维重构和精细数据分析,发现谷氨酸能突触囊泡密度较高,大小均一,空间分布集中并且更靠近活性区域(Active Zone);而GABA能突触囊泡的密度较低且各囊泡大小不均一,包含较多体积大、形状不规则的内体样囊泡(endosome-like vesicle),空间分布较为分散。我们进一步利用辣根过氧化物酶(HRP)标记回收囊泡(recycle vesicle),并在不同时间点固定,用电镜观察被标记的回收囊泡在两种突触中的形态和空间分布;实验结果表明谷氨酸能突触囊泡主要以单元囊泡的形式回收和再循环利用,而GABA能突触囊泡主要以内体样大囊泡形式回收,15分钟后这些内体样大囊泡则会分解成小突触囊泡。  结合电生理、FM成像和电镜的实验结果,我们认为谷氨酸能和GABA能突触囊泡在功能囊泡池(vesicle pool)构成、回收和循环再利用等方面存在显著差异:谷氨酸能突触回收囊泡占全部囊泡比重很小,主要依赖巨大数量的储存囊泡对RRP进行快速补充;而GABA能突触的储存囊泡少,回收囊泡占全部囊泡的比例高,其RRP的恢复主要依赖从内体样大囊泡分解产生的小囊泡,该过程耗时较长;这些差异是两种突触传递具有不同功能特性的重要基础。我们的实验结果、实验和分析方法也为以后进一步研究两种突触囊泡的产生、释放及回收再循环的分子调控机制的差异及其生理意义打下了基础。
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