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目的观察不同光照强度及时间对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)的影响,以及不同浓度枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞损伤的细胞形态、线粒体结构以及抗氧化作用,并研究不同浓度枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞凋亡以及对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。从而探讨枸杞多糖是否可以减轻光诱导ARPE-19细胞的氧化应激损伤及其在PI3K/Akt/mTOR信号通路中的调控作用。方法运用MTT法检测不同光照强度(8500±200)Lux、(12500±200)Lux、(16500±200)Lux分别照射ARPE-19细胞24h、36h后对ARPE-19细胞存活率的影响,并筛选最佳光照强度、时间;同时采用MTT法检测不同浓度枸杞多糖(10mg/L、100mg/L)对光诱导ARPE-19细胞24h存活率的影响。通过倒置显微镜观察不同浓度枸杞多糖(10mg/L、100mg/L)对光诱导ARPE-19细胞形态的影响,通过线粒体绿色荧光探针观察不同浓度枸杞多糖(10mg/L、100mg/L)对光诱导ARPE-19细胞线粒体形态及结构的影响。采用酶联免疫吸附试验检测不同浓度枸杞多糖(10mg/L、100mg/L)对光诱导ARPE-19细胞总超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量的影响。流式细胞仪检测不同浓度枸杞多糖(10mg/L、100mg/L)对光诱导ARPE-19细胞内活性氧自由基含量及细胞凋亡率的影响。通过蛋白免疫印迹(Western blot)法检测不同浓度枸杞多糖(10mg/L、100mg/L)对光照ARPE-19细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt(Thr308)、mTOR、p-mTOR蛋白分子表达量的影响。结果1.运用MTT法检测不同光照强度诱导ARPE-19细胞24h、36h后对ARPE-19细胞存活率的影响:同时相内不同处理组之间的比较:与空白对照组比较,各光照强度组细胞存活率均显著降低,尤以(16500±200)Lux时最明显,差异具有统计学意义(P<0.01),并且光照对ARPE-19细胞的存活率作用具有强度依赖性。不同时相内同一处理组之间的比较:各处理组细胞存活率均随时间延长有所降低,即光照对ARPE-19细胞的存活率具有时间依赖性,综合以上,光诱导ARPE-19最佳光照强度为(16500±200)Lux,最适时间为24h。2.MTT法检测不同浓度枸杞多糖干预24h光诱导的ARPE-19细胞存活率的影响:与空白对照组比较:光损伤模型组ARPE-19细胞存活率显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。与光损伤模型组比较,枸杞多糖10mg/L、100mg/L组细胞存活率显著升高,差异具有显著性(P<0.01)。且随着枸杞多糖浓度的升高,光诱导ARPE-19细胞存活率显著升高。3.枸杞多糖对光诱导的ARPE-19细胞形态学影响:空白对照组的ARPE-19细胞呈梭形贴壁生长,边界清晰,细胞质内色素颗粒分布均匀,细胞融合生长时呈单层、镶嵌式排列,细胞状态良好;光损伤模型组细胞呈梭长形改变,部分缩小变圆,边界欠清,细胞内色素颗粒分布不均,失去镶嵌式排列特性,且细胞碎片增多,细胞状态不良。枸杞多糖10mg/L、100mg/L组细胞状态改善明显。4.枸杞多糖对光诱导的ARPE-19细胞线粒体损伤形态学观察:空白对照组线粒体环绕细胞核散布于胞浆,呈线状、管网状或分枝状分布;光损伤模型组线粒体肿胀,表现为细小的颗粒状结构;枸杞多糖10mg/L线粒体形态以管网状为主,较光损伤模型组改善,枸杞多糖100mg/L组细胞线粒体形态以线状和管网状为主,较光损伤模型组显著改善。5.流式细胞仪检测枸杞多糖对光诱导的ARPE-19细胞活性氧水平的影响:与空白对照组比较,光损伤模型组ARPE-19细胞ROS水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),说明光照可以诱导ARPE-19细胞内ROS水平升高;与光损伤模型组比较,枸杞多糖10mg/L、100mg/L组细胞ROS水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01),说明枸杞多糖可以降低ARPE-19细胞光损伤后ROS水平;与枸杞多糖10 mg/L比较,枸杞多糖100mg/L组ARPE-19细胞ROS水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01),说明随着枸杞多糖浓度的升高,光诱导ARPE-19细胞内ROS水平显著降低,枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞具有保护作用,并且呈浓度依赖性。6.酶联免疫吸附试验检测枸杞多糖对光诱导的ARPE-19细胞总SOD活性和MDA含量的影响:与空白对照组比较,光损伤模型组ARPE-19细胞中MDA含量明显增多,差异具有统计学意义(P<0.01);与光损伤模型组比较,枸杞多糖10mg/L、100mg/L组ARPE-19细胞中MDA含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与枸杞多糖10 mg/L比较,枸杞多糖100mg/L组ARPE-19细胞MDA含量降低,差异具有统计学意义(P<0.01);表明光照可以诱导ARPE-19细胞MDA含量增多,而枸杞多糖能降低光损伤后ARPE-19细胞中MDA含量,随着枸杞多糖浓度的升高,光诱导ARPE-19细胞内MDA含量显著降低,枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞具有保护作用,并且呈浓度依赖性。此外,与空白对照组相比,光损伤模型组ARPE-19细胞中SOD活力降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与光损伤模型组比较,枸杞多糖10mg/L、100mg/L组ARPE-19细胞中SOD活力明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01);与枸杞多糖10 mg/L比较,枸杞多糖100mg/L组ARPE-19细胞总SOD活性显著增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。表明光照可以诱导ARPE-19细胞总SOD活性降低,而枸杞多糖能升高光损伤后ARPE-19细胞中总SOD活性,随着枸杞多糖浓度的升高,光诱导ARPE-19细胞内总SOD活性显著增加,枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞具有保护作用,并且呈浓度依赖性。7.流式细胞术检测枸杞多糖对光诱导ARPE-19细胞凋亡的影响:与空白对照组相比,光损伤模型组ARPE-19细胞凋亡率显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与光损伤模型组比较,枸杞多糖10mg/L、100mg/L组ARPE-19细胞凋亡率显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与枸杞多糖10mg/L组相比,枸杞多糖100mg/L组ARPE-19细胞凋亡率降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。说明光照可以促进ARPE-19细胞凋亡,而枸杞多糖各处理组处理后,随着枸杞多糖浓度升高,ARPE-19细胞凋亡率逐渐降低,且呈浓度依赖性。8.Western blot法检测各组对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响:ARPE-19细胞经24h、(16500±200)Lux光照诱导后,细胞中PI3K、Akt(Thr308)及mTOR磷酸化水平降低,差异具有统计学意义(P>0.01);而给予枸杞多糖10mg/L、100mg/L处理后,细胞中的PI3K、Akt(Thr308)及mTOR磷酸化水平均升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与枸杞多糖10mg/L组相比,枸杞多糖100mg/L组ARPE-19细胞中PI3K、Akt(Thr308)及mTOR磷酸化水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),说明枸杞多糖可增强光诱导的ARPE-19细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的活性,保护光照诱导的ARPE-19细胞损伤,并且呈浓度依赖性。结论1.光照24h、36h均可明显降低ARPE-19细胞存活率,其中光诱导ARPE-19最佳光照强度为(16500±200)Lux,最适时间为24h。2.光照可诱导ARPE-19细胞形态及线粒体结构改变,并且能够导致ARPE-19细胞氧化应激损伤,而枸杞多糖不仅可以改善ARPE-19细胞形态及线粒体结构,而且能够通过抗氧化功能对光诱导损伤的ARPE-19细胞起到保护作用。3.枸杞多糖可显著降低光诱导ARPE-19细胞氧化应激损伤后的凋亡率,且随着浓度增大,凋亡率呈降低趋势。此外,枸杞多糖可能是通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路从而发挥其对光诱导ARPE-19细胞损伤的保护作用。