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白介素18(IL-18)是一种新型细胞因子，具有强烈的IFN-γ诱生能力，能促进T细胞增殖和NK细胞活性，在抗微生物感染、免疫调节等方面发挥作用。研究表明，IL-18作为疫苗佐剂方面具有良好的应用前景，有望成为新一代的疫苗佐剂。猪是一种重要的经济动物，利用DNA重组技术生产有广泛免疫调节效应的基因工程猪白介素18(IL-18)有着重要意义。本研究为进行重组猪IL-18成熟蛋白(rmpoIL-18)制备及应用的基础研究，进行了如下试验。
1.原核表达的重组猪IL-18成熟蛋白(rmpoIL-18)制备试验
根据已发表的猪IL-18成熟蛋白(mpoIL-18)的cDNA基因序列，设计一对含有EcoRI和XbaI酶切位点的特异性引物。以杜长大三元杂交猪肝细胞中抽提的总RNA，RT-PCR扩增、克隆猪IL-18成熟蛋白基因；将该基因插入原核融合表达载体pMAL-C2x中，构建猪IL-18原核表达载体pMAL-mpoIL-18，转化TBl大肠杆菌，优化重组菌株表达条件，进行高效表达，表达菌液超声破碎，提取可溶性融合蛋白进行亲和层析纯化。用猪IL-18单克隆抗体进行Western-blotting鉴定纯化的rmpoIL-18。
2.酵母表达的重组猪IL-18成熟蛋白(rmpoIL-18)制备试验
应用设计的特异性引物，以猪IL-18的cDNA为模板，扩增猪IL-18成熟蛋白基因，与毕赤酵母分泌型表达载体连接，构建pPICZ α-C-mpoIL-18重组质粒，转化大肠杆菌DH5 α进行扩增，将经过鉴定为阳性的重组质粒线性化处理后电转化至毕赤酵母菌株X-33，采用抗生素Zeocin筛选整合菌株，提取整合酵母菌株的基因组DNA，以此为模板做PCR反应鉴定阳性克隆，将筛选获得含猪IL-18成熟蛋白基因的重组酵母菌株通过BMGY/BMMY培养基两步法培养、甲醇诱导表达，诱导菌液上清用SDS-PAGE电泳、dot botting进行分析鉴定。
3.以原核表达的rmIL-18作疫苗佐剂的初步研究试验
以小鼠作试验模型，应用原核表达纯化的rmIL-18，作为猪瘟弱毒疫苗的免疫佐剂，采用间接ELISA方法和T细胞转化试验MTT法检测其对试验小鼠血清猪瘟IgG抗体水平和脾脏T淋巴细胞增殖反应的影响。
本研究获得以下结果：
1.克隆到杜长大三元杂交猪IL-18成熟蛋白编码基因，包括终止密码子在
内全长为474bp，编码157个氨基酸。其序列与GenBank上报道的mpoIL-18基因序列同源性为99.4％～99.8％，其推导氨基酸序列同源性为98.7％～99.4％。
2. 成功构建原核表达质粒pMAL-mpoIL-18。经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表达的融合蛋白分子量约为61kDa，与预期的大小相吻合；优化了最佳表达条件：在含Amp150μg/mL的LB诱导培养基中，37℃以1mmol/L IPTG诱导培养6h。表达产物纯化后可获得1.52mg/mL重组猪mpoIL-18；纯化表达产物，经Western-boltting鉴定具有生物学活性。
3.成功构建了猪IL-18成熟蛋白基因的酵母表达载体pPICZ α C-mpoIL-18。该重组表达载体经线性化后电转化入巴斯德毕赤酵母菌株X-33中，通过鉴定筛选，获得了分泌性表达、其表型为Mut+的mpoIL-18成熟蛋白基因重组酵母菌株；在甲醇诱导下实现了表达，其表达产物分子质量约为18kDa，并能被猪IL-18单克隆抗体所识别。
4. 应用原核表达的重组mpoIL-18蛋白作为猪瘟弱毒疫苗免疫小鼠的佐剂，结果显示重组猪IL-18可有效提高试验鼠血清猪瘟IgG抗体水平，增强其脾脏淋巴细胞增殖反应，具有良好的佐剂作用。