论文部分内容阅读
气孔是由两个高度特化的保卫细胞合围而成的孔隙。渗透压的改变引起保卫细胞收缩或膨胀进而导致气孔发生运动，这对于植物进行光合作用和蒸腾作用过程中的气体和水分交换至关重要。在经典的植物生理学中，关于调控气孔运动的机理存在两种假说:离子泵假说和淀粉-糖假说。随着分子生物学的不断深入研究，越来越多的实验数据支持离子泵假说，而对于淀粉-糖假说的实验证据却比较少。
淀粉是植物体中碳水化合物的主要储存形式。为适应环境的改变，植物体内的淀粉会表现出相应合成或降解的反应。保卫细胞中的淀粉对气孔的运动起着关键的调控作用，其降解异常或不能降解都会导致植物气孔不能正常开放。保卫细胞中淀粉降解的时间和程度受到外界环境信号、体内激素信号及发育信号的精细调控，但其调控的分子机理目前还不太清楚。油菜素内酯(BR)是植物体内重要甾醇类激素，参与了植物的多个生长发育过程，并对植物的气孔运动起着关键的调控作用。本研究通过分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学等手段对BR诱导保卫细胞淀粉降解进而促进气孔开放的分子机制进行了探究，具体的研究结果如下:
1.BR和BZR1参与调控保卫细胞淀粉降解和气孔开放过程
为研究BR调控气孔运动的分子机制，我们系统的分析了BR合成、BR不敏感以及BR信号增强的植物材料。研究表明BR缺陷的突变体det2，rot3和BR不敏感突变体bri1-116，bzr1和bes1都会导致气孔张开的幅度减小，而BR合成增加材料DWF4-Ox或BR信号增强材料BRI1-Ox和bzr1-1D都表现出气孔张开幅度变大的表型。由这些实验表明BR促进气孔开放。
保卫细胞中的淀粉降解对气孔开放起着关键的调控作用，为探讨BR促进气孔开放是否与保卫细胞中的淀粉降解相关，我们对BR相关突变体的气孔运动及淀粉代谢进行研究分析，野生型植株见光1小时内保卫细胞淀粉迅速降解，随后缓慢积累直到午夜淀粉含量达到峰值。在BR不敏感突变体bri1-116和BR缺失突变体det2保卫细胞中淀粉积累并且见光后淀粉降解速率减慢，BR功能获得型突变体bzr1-1D能够抑制bri1-116和det2保卫细胞淀粉过量积累以及见光后保卫细胞淀粉不能正常降解的表型。而对全叶片中的淀粉含量而言，bri1-116和det2中的淀粉含量较低，并且bzr1-1D并不能恢复两突变体叶片中的淀粉含量。此外，bri1-116突变体随着见光时间的延长气孔缓慢张开，但与野生型相比气孔开度明显变小，bzr1-1D能够部分恢复bri1-116和det2气孔开度小的表型。所以BR特异参与保卫细胞淀粉降解以及气孔的开放。bzr1和bes1突变后保卫细胞淀粉降解速率减慢，气孔开度轻微变小。由此表明，BR通过BZR1/BES1正向调控保卫细胞淀粉降解和气孔开放，而其他细胞的淀粉代谢不依赖于BZR1途径。
2.H2O2在保卫细胞淀粉降解和气孔开放中发挥重要作用
目前许多研究认为H2O2作为信号分子与BR信号协同参与植物抗病、根尖干细胞维持、胁迫响应等各种生理过程。为探讨H2O2是否参与BR介导的气孔开放过程，我们通过化学试剂DPI和KI清除野生型植物体内的H2O2后进行BR处理实验，气孔开度表型分析显示植物体内H2O2的缺失导致植物材料的气孔开度对BR不敏感。对ROS缺失相关突变体rbohd rbohf、CAT2-Ox遗传材料进行BR处理后，发现BR对rbohd rbohf、CAT2-Ox见光后保卫细胞淀粉降解速率和气孔开放程度没有显著影响。由此验证了我们的猜想，H2O2在BR介导的气孔开放过程中扮演重要角色。
此外，我们通过实验分析发现H2O2促进淀粉的降解也需要BR的参与。先前H2O2一直被认为是植物有氧代谢产生的有毒物质，参与气孔关闭过程。而在我们研究中发现H2O2调控气孔运动具有浓度效应，低浓度H2O2促进气孔开放，高浓度H2O2抑制气孔开放。BR合成缺失突变体det2和BR不敏感突变体bri1-116、bri1-301的气孔开度对外源施加的低浓度H2O2并不敏感。bzr1和bes1突变体的气孔对H2O2表现出弱敏感表型。对野生型Col-0外源施加一定浓度的BR和H2O2，两者都能够促进保卫细胞淀粉降解。因此H2O2和BR相互依赖促进保卫细胞淀粉降解进而引起气孔开放。
3.BZR1与GBF2协同促进保卫细胞淀粉降解和气孔开放
基于BZR1能整合BR和H2O2信号来促进细胞伸长，我们猜测这两种信号可能通过BZR1与其他转录因子的相互作用来调控保卫细胞淀粉降解和气孔开放。为验证这种可能性，我们通过酵母双杂交筛选BZR1互作蛋白，并对其中与BZR1有相互作用的转录因子进行深入分析。在本课题中我们选定了一个bZIP类的转录因子GBF2进行研究。
对保卫细胞淀粉降解和气孔运动表型进行分析，gbf2-1突变体表现出气孔小的表型。GBF2-Ox与野生型Col-0相比气孔开放较大，并且外源施加一定浓度的H2O2和BR对gbf2-1突变体有微弱的影响。此外，gbf2-1见光后保卫细胞淀粉降解速率减慢，GBF2过表达后保卫细胞淀粉表现正常的降解反应。GBF2缺失导致bzr1-1D淀粉积累并且保卫细胞淀粉见光迅速降解受到破坏。在气孔运动方面，GBF2的缺失也抑制bzr1-1D见光气孔变大的表型。因此，GBF2在BZR1促进淀粉降解和气孔运动过程中起重要作用，两者协同促进保卫细胞淀粉降解进而促使气孔开放。
对产生以上表型的分子机制我们进行了探究，在转录水平分析发现BZR1和GBF2能够在转录水平上上调BAM1的表达。ChIP-qPCR结果显示BZR1以及GBF2可以直接结合在BAM1启动子上。由此可见，BZR1和GBF2通过直接对BAM1进行转录调控进而促进保卫细胞淀粉降解和气孔开放。
4.BR和H2O2促进气孔开放依赖BAM1的参与
α-淀粉酶和β-淀粉酶在保卫细胞淀粉降解过程中发挥重要功能。其中β-淀粉酶基因BAM1和α-淀粉酶基因AMY3优先在保卫细胞中表达。BAM1突变后，突变体bam1-1、bam1-1amy3对BR和H2O2引起的气孔开放没有响应。并且BAM1突变能够破坏bzr1-1D和GBF2-Ox气孔开放的现象。在转录水平对BAM1的表达量进行分析，外源施加一定浓度的BL和H2O2能够上调BAM1mRNA的表达，而且可以促进ProBAM1∶GFP荧光信号的积累。
综上所述，BR和H2O2在气孔运动方面具有双重调控作用，低浓度促进气孔开放，高浓度促进气孔关闭。植物通过受体BRI1感知一定浓度的BR信号，使得植物体内积累一定量的H2O2，H2O2增强BZR1和GBF2的相互作用，两者直接在转录水平上调控BAM1的表达，β-淀粉酶含量或者活性的增加促进保卫细胞淀粉降解，进而引起气孔开放。当没有BR或者BR含量较低时，使得体内H2O2含量较低，BAM1表达量减少，保卫细胞淀粉积累并且降解速率减慢，所以导致气孔开度变小。通过本文研究，我们揭示了BR和H2O2调控气孔运动的新机制，这为BR和H2O2平衡植物生长和抗旱的研究提供了科学依据，也为作物专家提高作物产量的研究奠定理论基础。
淀粉是植物体中碳水化合物的主要储存形式。为适应环境的改变，植物体内的淀粉会表现出相应合成或降解的反应。保卫细胞中的淀粉对气孔的运动起着关键的调控作用，其降解异常或不能降解都会导致植物气孔不能正常开放。保卫细胞中淀粉降解的时间和程度受到外界环境信号、体内激素信号及发育信号的精细调控，但其调控的分子机理目前还不太清楚。油菜素内酯(BR)是植物体内重要甾醇类激素，参与了植物的多个生长发育过程，并对植物的气孔运动起着关键的调控作用。本研究通过分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学等手段对BR诱导保卫细胞淀粉降解进而促进气孔开放的分子机制进行了探究，具体的研究结果如下:
1.BR和BZR1参与调控保卫细胞淀粉降解和气孔开放过程
为研究BR调控气孔运动的分子机制，我们系统的分析了BR合成、BR不敏感以及BR信号增强的植物材料。研究表明BR缺陷的突变体det2，rot3和BR不敏感突变体bri1-116，bzr1和bes1都会导致气孔张开的幅度减小，而BR合成增加材料DWF4-Ox或BR信号增强材料BRI1-Ox和bzr1-1D都表现出气孔张开幅度变大的表型。由这些实验表明BR促进气孔开放。
保卫细胞中的淀粉降解对气孔开放起着关键的调控作用，为探讨BR促进气孔开放是否与保卫细胞中的淀粉降解相关，我们对BR相关突变体的气孔运动及淀粉代谢进行研究分析，野生型植株见光1小时内保卫细胞淀粉迅速降解，随后缓慢积累直到午夜淀粉含量达到峰值。在BR不敏感突变体bri1-116和BR缺失突变体det2保卫细胞中淀粉积累并且见光后淀粉降解速率减慢，BR功能获得型突变体bzr1-1D能够抑制bri1-116和det2保卫细胞淀粉过量积累以及见光后保卫细胞淀粉不能正常降解的表型。而对全叶片中的淀粉含量而言，bri1-116和det2中的淀粉含量较低，并且bzr1-1D并不能恢复两突变体叶片中的淀粉含量。此外，bri1-116突变体随着见光时间的延长气孔缓慢张开，但与野生型相比气孔开度明显变小，bzr1-1D能够部分恢复bri1-116和det2气孔开度小的表型。所以BR特异参与保卫细胞淀粉降解以及气孔的开放。bzr1和bes1突变后保卫细胞淀粉降解速率减慢，气孔开度轻微变小。由此表明，BR通过BZR1/BES1正向调控保卫细胞淀粉降解和气孔开放，而其他细胞的淀粉代谢不依赖于BZR1途径。
2.H2O2在保卫细胞淀粉降解和气孔开放中发挥重要作用
目前许多研究认为H2O2作为信号分子与BR信号协同参与植物抗病、根尖干细胞维持、胁迫响应等各种生理过程。为探讨H2O2是否参与BR介导的气孔开放过程，我们通过化学试剂DPI和KI清除野生型植物体内的H2O2后进行BR处理实验，气孔开度表型分析显示植物体内H2O2的缺失导致植物材料的气孔开度对BR不敏感。对ROS缺失相关突变体rbohd rbohf、CAT2-Ox遗传材料进行BR处理后，发现BR对rbohd rbohf、CAT2-Ox见光后保卫细胞淀粉降解速率和气孔开放程度没有显著影响。由此验证了我们的猜想，H2O2在BR介导的气孔开放过程中扮演重要角色。
此外，我们通过实验分析发现H2O2促进淀粉的降解也需要BR的参与。先前H2O2一直被认为是植物有氧代谢产生的有毒物质，参与气孔关闭过程。而在我们研究中发现H2O2调控气孔运动具有浓度效应，低浓度H2O2促进气孔开放，高浓度H2O2抑制气孔开放。BR合成缺失突变体det2和BR不敏感突变体bri1-116、bri1-301的气孔开度对外源施加的低浓度H2O2并不敏感。bzr1和bes1突变体的气孔对H2O2表现出弱敏感表型。对野生型Col-0外源施加一定浓度的BR和H2O2，两者都能够促进保卫细胞淀粉降解。因此H2O2和BR相互依赖促进保卫细胞淀粉降解进而引起气孔开放。
3.BZR1与GBF2协同促进保卫细胞淀粉降解和气孔开放
基于BZR1能整合BR和H2O2信号来促进细胞伸长，我们猜测这两种信号可能通过BZR1与其他转录因子的相互作用来调控保卫细胞淀粉降解和气孔开放。为验证这种可能性，我们通过酵母双杂交筛选BZR1互作蛋白，并对其中与BZR1有相互作用的转录因子进行深入分析。在本课题中我们选定了一个bZIP类的转录因子GBF2进行研究。
对保卫细胞淀粉降解和气孔运动表型进行分析，gbf2-1突变体表现出气孔小的表型。GBF2-Ox与野生型Col-0相比气孔开放较大，并且外源施加一定浓度的H2O2和BR对gbf2-1突变体有微弱的影响。此外，gbf2-1见光后保卫细胞淀粉降解速率减慢，GBF2过表达后保卫细胞淀粉表现正常的降解反应。GBF2缺失导致bzr1-1D淀粉积累并且保卫细胞淀粉见光迅速降解受到破坏。在气孔运动方面，GBF2的缺失也抑制bzr1-1D见光气孔变大的表型。因此，GBF2在BZR1促进淀粉降解和气孔运动过程中起重要作用，两者协同促进保卫细胞淀粉降解进而促使气孔开放。
对产生以上表型的分子机制我们进行了探究，在转录水平分析发现BZR1和GBF2能够在转录水平上上调BAM1的表达。ChIP-qPCR结果显示BZR1以及GBF2可以直接结合在BAM1启动子上。由此可见，BZR1和GBF2通过直接对BAM1进行转录调控进而促进保卫细胞淀粉降解和气孔开放。
4.BR和H2O2促进气孔开放依赖BAM1的参与
α-淀粉酶和β-淀粉酶在保卫细胞淀粉降解过程中发挥重要功能。其中β-淀粉酶基因BAM1和α-淀粉酶基因AMY3优先在保卫细胞中表达。BAM1突变后，突变体bam1-1、bam1-1amy3对BR和H2O2引起的气孔开放没有响应。并且BAM1突变能够破坏bzr1-1D和GBF2-Ox气孔开放的现象。在转录水平对BAM1的表达量进行分析，外源施加一定浓度的BL和H2O2能够上调BAM1mRNA的表达，而且可以促进ProBAM1∶GFP荧光信号的积累。
综上所述，BR和H2O2在气孔运动方面具有双重调控作用，低浓度促进气孔开放，高浓度促进气孔关闭。植物通过受体BRI1感知一定浓度的BR信号，使得植物体内积累一定量的H2O2，H2O2增强BZR1和GBF2的相互作用，两者直接在转录水平上调控BAM1的表达，β-淀粉酶含量或者活性的增加促进保卫细胞淀粉降解，进而引起气孔开放。当没有BR或者BR含量较低时，使得体内H2O2含量较低，BAM1表达量减少，保卫细胞淀粉积累并且降解速率减慢，所以导致气孔开度变小。通过本文研究，我们揭示了BR和H2O2调控气孔运动的新机制，这为BR和H2O2平衡植物生长和抗旱的研究提供了科学依据，也为作物专家提高作物产量的研究奠定理论基础。