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海洋是地球上最大的生态系统，海洋微生物在海洋生态系统和地球生物化学循环中起着极其重要的作用。几丁质是海洋中含量最丰富的有机碳，海洋微生物对几丁质的降解代谢，是海洋物质循环的重要推动力。海洋中能够降解几丁质的微生物有很多，但绝大多数海洋微生物降解几丁质的机制仍不清楚。假交替单胞菌属是海洋特有细菌，其广泛分布于全球海洋中，并具有相对较高的丰度。最近，基于生物信息学分析，有研究表明较高比例的假交替单胞菌中含有几丁质降解基因簇(CDC)，预示着假交替单胞菌属可能是海洋中重要的几丁质降解细菌类群。但是，到目前为止，关于假交替单胞菌的几丁质降解能力的研究还较少，缺少在属水平开展假交替单胞菌降解几丁质的系统研究，假交替单胞菌在海洋几丁质降解中的贡献还不清楚。假交替单胞菌降解几丁质的机制也不清楚。
本文较为系统地在属水平分析了假交替单胞菌对几丁质的降解，揭示出假交替单胞菌在海洋几丁质的降解中发挥重要作用，并对其中一株几丁质降解菌P.flavipulchra DSM14401T中参与胞外几丁质降解的关键酶基因进行了鉴定和表征。此外，本文还从几丁质降解菌P.aurantia DSM6057T中鉴定出一个属于GH18家族的新型内切几丁质酶Chi23，并解析了它的晶体结构，阐明了其催化机制。对海洋假交替单胞菌及其几丁质酶的研究，将有助于阐明海洋微生物降解海洋几丁质的机制。
一、假交替单胞菌属的几丁质降解能力分析及其在海洋几丁质降解中的作用
为了研究假交替单胞菌属在海洋几丁质降解中的作用，本文对来自全球不同海域的假交替单胞菌的26个模式种以及从黄海海域不同样品中筛选到的139株假交替单胞菌进行了几丁质降解能力的分析。基于16S rRNA基因分析，这165株测试菌至少涵盖了假交替单胞菌属中的35个种。同时，本文还分析了两株深海假交替单胞菌菌株SM9913和CF6-2的几丁质降解能力。通过分析这167株假交替单胞菌（涵盖了假交替单胞菌74％的种）的几丁质降解能力，揭示出超过20％的菌株能够降解胶体几丁质且能以胶体几丁质及其降解产物——几丁二糖等寡糖为唯一碳源进行生长，并且这些几丁质降解菌多数分离自表层海水和藻类样品，表明假交替单胞菌是海洋环境中重要的几丁质降解类群，尤其在上层海水几丁质的降解中发挥着重要作用。随后，通过检测以胶体几丁质为唯一碳源培养的几丁质降解菌的胞外粗酶液的几丁质酶活性，揭示出几乎所有的几丁质降解菌均具有胞外几丁质酶和n-乙酰葡萄糖胺酶活性，这表明几丁质酶等糖苷水解酶在假交替单胞菌对几丁质的降解中发挥重要作用。本文还以几丁五糖作为唯一碳源培养几丁质降解菌株来模拟假交替单胞菌对自然界中几丁质的降解情况。所有测试菌株在几丁五糖中的产几丁质酶曲线趋势与菌株的生长曲线相一致，胞外几丁质酶活力随着细胞浓度的增加而升高，当细胞达到稳定期时酶活力也达到最大值，为0.4-3.2U/mL。此外，通过基因组分析，找到了假交替单胞菌中参与几丁质降解的潜在关键酶基因。具有几丁质降解活性的假交替单胞菌至少含有一个CDC几丁质降解基因簇以及多个位于CDC基因簇以外的几丁质酶基因和LPMO基因，多个几丁质降解酶基因的存在可能有助于假交替单胞菌降解海洋环境中多种不同形式的几丁质。基于dbCAN和Pfam分析，假交替单胞菌中的几丁质酶大多数属于GH18家族，所有的LPMO均属于AA10家族。
二、Pseudoalteromonasflavipulchra DSM14401T中几丁质降解酶基因的鉴定及其功能分析
Pseudoalteromonas flavipulchra DSM14401T是一株分离自法国尼斯表层海水的模式菌株，该菌株能快速利用胶体几丁质和结晶几丁质，表现出高效的几丁质降解能力。为了研究假交替单胞菌降解几丁质的机制，本文对P.flavipulchra DSM14401T中的几丁质降解酶基因进行了鉴定及功能分析。基因组分析表明该菌株含有4个潜在GH18家族几丁质酶基因(pflab0431、pflab0434、pflaa4287和pflaa2822)、1个潜在的GH19家族几丁质酶基因(pflab0889)和2个潜在AA10家族LPMO基因（pflab0432和口pflab1147）。其中，pflab0431、pflab0432和pflab0434构成了CDC几丁质降解基因簇。比较转录组分析表明，除了pflab1147以外，其它6个几丁质降解酶基因均只在结晶几丁质或者n-乙酰葡萄糖胺为唯一碳源的培养基中培养DSM14401时显著上调表达，这些基因编码的蛋白均能在以结晶几丁质为唯一碳源培养的胞外蛋白组中被检测到且具有较高的丰度，表明这些基因共同参与了菌株P flavipulchra DSM14401T对结晶几丁质的降解。随后，本文对这6个几丁质降解酶基因进行了异源表达和分离纯化，以研究其功能。除了LPMO基因外，其余5个预测为几丁质酶基因均成功实现了表达。生化性质分析表明，PfChib0889和PfChia2822只能降解胶体几丁质，而PfChia4287和位于CDC基因簇的PfChib0431和PfChib0434对结晶几丁质和胶体几丁质均具有降解活性，这表明几丁质酶PfChib0431、PfChib0434和PfChia4287在P.flavipulchra DSM14401T对结晶几丁质的降解中发挥着关键作用。几丁质酶PfChib0431、PfChib0434和PfChia4287均为中温酶，最适反应温度在50-60℃间，并且具有很好的热稳定性，表明它们能够稳定地存在于海洋环境中，通过不断降解海洋环境中的几丁质，为其来源菌及其他海洋细菌的生长提供营养物质。
三、Pseudoalteromonas aurantia DSM6057T中GH18家族新型内切几丁质酶Chi23的催化特性分析
通过分析多株具有几丁质降解活性的假交替单胞菌的基因组以及对P.flavipulchra DSM14401T中关键几丁质降解酶基因进行功能分析揭示出，类似于其他的几丁质降解细菌，GH18家族几丁质酶在假交替单胞菌对几丁质的降解中发挥着重要作用。根据序列相似性，GH18家族几丁质酶又分为A、B和C三个亚家族。目前，相较于对A亚家族外切几丁质酶的广泛研究，对B和C亚家族内切几丁质酶的研究则较少。本文从具有几丁质降解活性的模式菌株Pseudoalteromonas aurantia DSM6057T中鉴定出一个GH18家族内切几丁质酶Chi23。系统发育分析表明，Chi23属于GH18家族的B亚家族。在已表征的酶蛋白中，Chi23与来源于植物Parkia platycephala种子的几丁质酶PPL2最相似，序列相似性仅为30％,这表明Chi23可能是一个新型的GH18家族几丁质酶。序列分析表明，Chi23可能是单结构域酶蛋白，只含有一个催化结构域。随后，对Chi23进行了异源表达和分离纯化。凝胶过滤层析分析表明，重组酶Chi23在溶液中以单体形式存在。生化分析表明，Chi23对结晶几丁质和胶体几丁质均具有降解活性，降解产物主要为几丁二糖和几丁三糖。通过薄层色谱法分析了Chi23对几丁六糖的水解产物随反应时间的变化，揭示出Chi23是一个内切几丁质酶。不同于已报道的内切几丁质酶，Chi23是GH18家族中目前唯一报道的具有结晶几丁质降解活性的单结构域酶。几丁质酶Chi23的最适反应温度为60℃，且在60℃非常稳定，在70℃保温1h后，仍保留40％的酶活力，最适反应pH为5.0，且能稳定存在于4.5M NaC1中，是一个耐热、耐盐的酸性几丁质酶。
四、Pseudoalteromonas aurantia DSM6057T中GH18家族新型内切几丁质酶Chi23降解几丁质及其热稳定性的结构基础
尽管GH18家族内切几丁质酶的结构已经被报道，但由于缺乏相关的突变与功能分析，GH18家族内切几丁质酶的催化机制到目前为止还不清楚。为了阐明GH18家族内切几丁质酶的催化机制，本文解析了新型内切几丁质酶Chi23的晶体结构，分辨率为1.8(A)。Chi23只含有一个催化结构域，其结构呈GH18家族典型的(β/α)8“TIM”桶结构。不同于其他细菌来源的GH18内切几丁质酶，Chi23不含几丁质结合结构域(CBD)和β发夹亚结构域且拥有较短的柔性loop，在结构上与真核来源的内切几丁质酶更为相似。随后，通过分子对接模建了Chi23结合几丁五糖的结构，通过结构、突变和生化分析，揭示出Chi23中参与底物结合和催化的关键氨基酸残基。进一步的比较结构分析表明，Asn9、Asp229和Gln261是Chi23特有的底物结合残基，在Chi23催化的几丁质降解中发挥着重要作用。这3个残基在底物结合和催化中的正向累积作用促成了单结构域几丁质酶Chi23对结晶几丁质和可溶几丁质的降解，使其具有和多结构域内切几丁质酶相当的结晶几丁质降解效率。此外，首次分析了底物结合关键残基在维持GH18家族内切几丁质酶热稳定上的作用。结果表明，-1和-2位的底物结合残基（Tyr189、Asn190、Asp229、Trp260和Gln261）在维持Chi23热稳定方面发挥着重要作用。结构分析表明Asp229和Gln261通过侧链与周围残基形成氢键网络来稳定Chi23蛋白的结构。本文对GH18家族内切几丁质酶Chi23开展的研究将有助于阐明海洋几丁质酶降解几丁质的分子机理，也为几丁质酶的后续工业应用奠定了基础。
本文较为系统地在属水平分析了假交替单胞菌对几丁质的降解，揭示出假交替单胞菌在海洋几丁质的降解中发挥重要作用，并对其中一株几丁质降解菌P.flavipulchra DSM14401T中参与胞外几丁质降解的关键酶基因进行了鉴定和表征。此外，本文还从几丁质降解菌P.aurantia DSM6057T中鉴定出一个属于GH18家族的新型内切几丁质酶Chi23，并解析了它的晶体结构，阐明了其催化机制。对海洋假交替单胞菌及其几丁质酶的研究，将有助于阐明海洋微生物降解海洋几丁质的机制。
一、假交替单胞菌属的几丁质降解能力分析及其在海洋几丁质降解中的作用
为了研究假交替单胞菌属在海洋几丁质降解中的作用，本文对来自全球不同海域的假交替单胞菌的26个模式种以及从黄海海域不同样品中筛选到的139株假交替单胞菌进行了几丁质降解能力的分析。基于16S rRNA基因分析，这165株测试菌至少涵盖了假交替单胞菌属中的35个种。同时，本文还分析了两株深海假交替单胞菌菌株SM9913和CF6-2的几丁质降解能力。通过分析这167株假交替单胞菌（涵盖了假交替单胞菌74％的种）的几丁质降解能力，揭示出超过20％的菌株能够降解胶体几丁质且能以胶体几丁质及其降解产物——几丁二糖等寡糖为唯一碳源进行生长，并且这些几丁质降解菌多数分离自表层海水和藻类样品，表明假交替单胞菌是海洋环境中重要的几丁质降解类群，尤其在上层海水几丁质的降解中发挥着重要作用。随后，通过检测以胶体几丁质为唯一碳源培养的几丁质降解菌的胞外粗酶液的几丁质酶活性，揭示出几乎所有的几丁质降解菌均具有胞外几丁质酶和n-乙酰葡萄糖胺酶活性，这表明几丁质酶等糖苷水解酶在假交替单胞菌对几丁质的降解中发挥重要作用。本文还以几丁五糖作为唯一碳源培养几丁质降解菌株来模拟假交替单胞菌对自然界中几丁质的降解情况。所有测试菌株在几丁五糖中的产几丁质酶曲线趋势与菌株的生长曲线相一致，胞外几丁质酶活力随着细胞浓度的增加而升高，当细胞达到稳定期时酶活力也达到最大值，为0.4-3.2U/mL。此外，通过基因组分析，找到了假交替单胞菌中参与几丁质降解的潜在关键酶基因。具有几丁质降解活性的假交替单胞菌至少含有一个CDC几丁质降解基因簇以及多个位于CDC基因簇以外的几丁质酶基因和LPMO基因，多个几丁质降解酶基因的存在可能有助于假交替单胞菌降解海洋环境中多种不同形式的几丁质。基于dbCAN和Pfam分析，假交替单胞菌中的几丁质酶大多数属于GH18家族，所有的LPMO均属于AA10家族。
二、Pseudoalteromonasflavipulchra DSM14401T中几丁质降解酶基因的鉴定及其功能分析
Pseudoalteromonas flavipulchra DSM14401T是一株分离自法国尼斯表层海水的模式菌株，该菌株能快速利用胶体几丁质和结晶几丁质，表现出高效的几丁质降解能力。为了研究假交替单胞菌降解几丁质的机制，本文对P.flavipulchra DSM14401T中的几丁质降解酶基因进行了鉴定及功能分析。基因组分析表明该菌株含有4个潜在GH18家族几丁质酶基因(pflab0431、pflab0434、pflaa4287和pflaa2822)、1个潜在的GH19家族几丁质酶基因(pflab0889)和2个潜在AA10家族LPMO基因（pflab0432和口pflab1147）。其中，pflab0431、pflab0432和pflab0434构成了CDC几丁质降解基因簇。比较转录组分析表明，除了pflab1147以外，其它6个几丁质降解酶基因均只在结晶几丁质或者n-乙酰葡萄糖胺为唯一碳源的培养基中培养DSM14401时显著上调表达，这些基因编码的蛋白均能在以结晶几丁质为唯一碳源培养的胞外蛋白组中被检测到且具有较高的丰度，表明这些基因共同参与了菌株P flavipulchra DSM14401T对结晶几丁质的降解。随后，本文对这6个几丁质降解酶基因进行了异源表达和分离纯化，以研究其功能。除了LPMO基因外，其余5个预测为几丁质酶基因均成功实现了表达。生化性质分析表明，PfChib0889和PfChia2822只能降解胶体几丁质，而PfChia4287和位于CDC基因簇的PfChib0431和PfChib0434对结晶几丁质和胶体几丁质均具有降解活性，这表明几丁质酶PfChib0431、PfChib0434和PfChia4287在P.flavipulchra DSM14401T对结晶几丁质的降解中发挥着关键作用。几丁质酶PfChib0431、PfChib0434和PfChia4287均为中温酶，最适反应温度在50-60℃间，并且具有很好的热稳定性，表明它们能够稳定地存在于海洋环境中，通过不断降解海洋环境中的几丁质，为其来源菌及其他海洋细菌的生长提供营养物质。
三、Pseudoalteromonas aurantia DSM6057T中GH18家族新型内切几丁质酶Chi23的催化特性分析
通过分析多株具有几丁质降解活性的假交替单胞菌的基因组以及对P.flavipulchra DSM14401T中关键几丁质降解酶基因进行功能分析揭示出，类似于其他的几丁质降解细菌，GH18家族几丁质酶在假交替单胞菌对几丁质的降解中发挥着重要作用。根据序列相似性，GH18家族几丁质酶又分为A、B和C三个亚家族。目前，相较于对A亚家族外切几丁质酶的广泛研究，对B和C亚家族内切几丁质酶的研究则较少。本文从具有几丁质降解活性的模式菌株Pseudoalteromonas aurantia DSM6057T中鉴定出一个GH18家族内切几丁质酶Chi23。系统发育分析表明，Chi23属于GH18家族的B亚家族。在已表征的酶蛋白中，Chi23与来源于植物Parkia platycephala种子的几丁质酶PPL2最相似，序列相似性仅为30％,这表明Chi23可能是一个新型的GH18家族几丁质酶。序列分析表明，Chi23可能是单结构域酶蛋白，只含有一个催化结构域。随后，对Chi23进行了异源表达和分离纯化。凝胶过滤层析分析表明，重组酶Chi23在溶液中以单体形式存在。生化分析表明，Chi23对结晶几丁质和胶体几丁质均具有降解活性，降解产物主要为几丁二糖和几丁三糖。通过薄层色谱法分析了Chi23对几丁六糖的水解产物随反应时间的变化，揭示出Chi23是一个内切几丁质酶。不同于已报道的内切几丁质酶，Chi23是GH18家族中目前唯一报道的具有结晶几丁质降解活性的单结构域酶。几丁质酶Chi23的最适反应温度为60℃，且在60℃非常稳定，在70℃保温1h后，仍保留40％的酶活力，最适反应pH为5.0，且能稳定存在于4.5M NaC1中，是一个耐热、耐盐的酸性几丁质酶。
四、Pseudoalteromonas aurantia DSM6057T中GH18家族新型内切几丁质酶Chi23降解几丁质及其热稳定性的结构基础
尽管GH18家族内切几丁质酶的结构已经被报道，但由于缺乏相关的突变与功能分析，GH18家族内切几丁质酶的催化机制到目前为止还不清楚。为了阐明GH18家族内切几丁质酶的催化机制，本文解析了新型内切几丁质酶Chi23的晶体结构，分辨率为1.8(A)。Chi23只含有一个催化结构域，其结构呈GH18家族典型的(β/α)8“TIM”桶结构。不同于其他细菌来源的GH18内切几丁质酶，Chi23不含几丁质结合结构域(CBD)和β发夹亚结构域且拥有较短的柔性loop，在结构上与真核来源的内切几丁质酶更为相似。随后，通过分子对接模建了Chi23结合几丁五糖的结构，通过结构、突变和生化分析，揭示出Chi23中参与底物结合和催化的关键氨基酸残基。进一步的比较结构分析表明，Asn9、Asp229和Gln261是Chi23特有的底物结合残基，在Chi23催化的几丁质降解中发挥着重要作用。这3个残基在底物结合和催化中的正向累积作用促成了单结构域几丁质酶Chi23对结晶几丁质和可溶几丁质的降解，使其具有和多结构域内切几丁质酶相当的结晶几丁质降解效率。此外，首次分析了底物结合关键残基在维持GH18家族内切几丁质酶热稳定上的作用。结果表明，-1和-2位的底物结合残基（Tyr189、Asn190、Asp229、Trp260和Gln261）在维持Chi23热稳定方面发挥着重要作用。结构分析表明Asp229和Gln261通过侧链与周围残基形成氢键网络来稳定Chi23蛋白的结构。本文对GH18家族内切几丁质酶Chi23开展的研究将有助于阐明海洋几丁质酶降解几丁质的分子机理，也为几丁质酶的后续工业应用奠定了基础。