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目的：(1)研究提取菊花中黄酮类化合物的最佳工艺条件,得到菊花黄酮提取物。(2)探索适合对菊花黄酮进行分离纯化的方法条件,制备出纯度较高的菊花黄酮。(3)分析鉴定该菊花黄酮的主要成分。(4)了解菊花黄酮是否能改善试验大鼠的脂代谢紊乱状态及可能的作用机制。
方法：(1)选用微波萃取法提取菊花黄酮,分别考察乙醇浓度、微波提取时间和料液比对菊花黄酮提取率的影响,在单因素试验结果的基础上设计L9(34)正交优化试验,探讨各影响因素综合作用条件下对提取率的影响,找出主、次影响因素和最佳组合条件参数,得到提取率最高的条件来提取制备菊花黄酮。(2)通过预试验及吸附特性,选取AB-8大孔吸附树脂对菊花黄酮提取物进行分离纯化,分析此树脂对菊花黄酮的静态及动态吸附、解吸特性,通过改变洗脱剂浓度、上样量和静置吸附时间探索较好的分离纯化条件,得到纯度较高的菊花黄酮。(3)利用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱-质谱联用(HPLC/MS)、二级质谱(MS/MS)等技术对得到的菊花黄酮进行分析,通过与标准物质比对、质谱进行分子量及结构分析,确定其中主要含有的黄酮类成分。(4)试验大鼠分为阴性对照组、高脂模型对照组、菊花黄酮低剂量组、菊花黄酮中剂量组和菊花黄酮高剂量组5个组,阴性对照组饲料配方参照美国营养学会推荐的AIN-93M试验动物合成饲料配方配制而成,该配方中的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质的含量是保证动物生长发育所必需的,在此基础上适当调整蛋白质和蔗糖的比例,增加饱和脂肪含量,制成高脂饲料,除阴性对照组外其余各组均饲以高脂饲料,受试物各组分别给予受试物菊花黄酮提取物25、50、100mg/bw·kg·d灌胃。连续喂养8周,测定各组大鼠体重,血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆围醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(NEFA)、脂蛋白脂酶(LPL)、载脂蛋白B(ApoB),取肝脏和主动脉弓作病理切片。取肾周脂肪组织,利用逆转录PCR的方法观察各组大鼠脂肪组织中过氧化物增殖激活受体PPARγ的表达。
结果：(1)单因素试验结果表明：最佳萃取工艺参数为乙醇浓度60％,料液比1:20,提取时间120s。正交试验结果表明,影响菊花黄酮微波提取的主要因素为乙醇浓度,其次为提取时间、料液比。最佳提取工艺条件为A2B3C2,即乙醇浓度60％,提取时间120s,料液比1:20。此时总黄酮提取率为4.83％,即选择此条件作为提取菊花黄酮的条件。(2)AB-8大孔吸附树脂可以有效地分离纯化山粗提物中的黄酮成分。在20cm×2.5cm的层析柱上样10ml,以蒸馏水冲洗,并以30％乙醇进行洗脱,收集洗脱液,在此条件下可获得纯度为84.5％的黄酮。(3)HPLC分析结果表明,样品中绝大多数成分均属黄酮类；此菊花黄酮类物质中主要含有木犀草素-7-葡萄糖茁(luteolin-7-glucoside)这一黄酮苷,在该菊花中的含量约为0.4％；进一步HPLC/MS分析发现,还可能含有芹菜素-7-葡萄糖苷(apigenin-7-glucoside)、木犀草素(luteolin)等成分；通过MS/MS正、负粒子条件下加电压撞击得到的结构碎片分析证实确实还含有芹菜素-7-葡萄糖苷、木犀草素和芹菜素。(4)动物实验结果表明,与高脂模型对照组相比,菊花黄酮受试物能降低脂代谢紊乱大鼠TG、TC、LDL-C、NEFA水平,升高血清HDL-C这一保护性因子水平,而且能够明显提高LPL活性,降低ApoB水平,减轻肝脏脂肪变性程度,减轻主动脉弓粥样硬化程度,效果以菊花黄酮高剂量组最为明显,而且从结果来看对胆固醇代谢的影响更好。同时RT-PCR结果表明,菊花黄酮能增加脂肪组织中PPARγmRNA的表达水平,从而发挥对脂代谢紊乱的调节作用。
结论：(1)微波萃取法,是一种新型高效的提取方法,与回流提取法相比,具有高效无污染等优点,有广阔的发展前景。试验证实其适合提取菊花中的黄酮成分,最佳提取工艺条件为乙醇浓度60％,提取时间120s,料液比1:20,提取率为4.83％。(2)AB-8大孔吸附树脂可以有效地分离纯化出粗提物中的黄酮成分,最佳条件为：在20cm×2.5cm的层析柱上样10ml,以蒸馏水冲洗,并以30％乙醇进行洗脱,收集洗脱液,在此条件下可获得纯度为84.5％的黄酮。AB-8大孔吸附树脂亲和层析法可以较好地分离纯化菊花黄酮粗提物中的黄酮类物质,该树脂的吸附特性适合于分离菊花中的黄酮类成分,可得到较高纯度的菊花黄酮,为进一步分析及进行功效试验奠定了基础。(3)按所述方法制备分离得到的成分绝大部分属黄酮类,证实此提取纯化方法是可行的。该品种菊花中确实含有菊花HPLC指纹图谱中的木犀草素-7-葡萄糖苷和芹菜素-7-葡萄糖苷,且含量相对较高,此外还含有木犀草素和芹菜素；对其他黄酮类成分的鉴定尚需做进一步定性、定量分析。(4)菊花黄酮对大鼠脂代谢紊乱具有良好的调节作用,可能通过提高脂代谢关键酶活性、调节载脂蛋白的分泌等发挥改善血脂、减轻肝脏脂肪变性,减轻动脉粥样硬化的作用,也有可能同时作为PPARγ的配体激活PPAR途径发挥对脂代谢紊乱的调控作用。