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目的：IVF周期中大剂量促排卵药物使用后多卵泡同时发育所产生的超生理剂量的雌激素水平被认为和ART不良妊娠结局密切相关。实验室前期研究发现ART来源胎盘紧密连接功能异常,由此推测IVF周期高雌激素可能通过胎盘紧密连接进而影响滋养细胞侵袭能力,引发相关妊娠合并症。前期实验室已建立滋养细胞体外培养模型,通过免疫荧光开展了滋养细胞紧密连接因子的表达和定位研究,并通过跨上皮电阻和细胞旁渗透性的测定实现了紧密连接功能的评估。本研究检测正常自然妊娠女性妊娠早期和足月分娩时外周血、绒毛组织或胎盘组织中雌二醇(E2)水平以及足月分娩时脐动脉血E2水平；拟探讨生理和超生理浓度雌激素对滋养细胞紧密连接功能及侵袭能力的影响；进一步研究IVF超生理雌激素水平和不良妊娠结局关联,为优化ART条件、提高ART技术安全性提供新的依据。材料和方法：(1)本研究纳入20例非意愿妊娠行妊娠早期流产者、20例足月妊娠行剖宫产者,采用化学发光免疫分析(CLIA)检测妊娠早期流产绒毛组织、孕妇外周血以及分娩时孕妇外周血、脐动脉血和胎盘组织中E2水平。(2)利用Millicell小室系统培养BeWo细胞,建立体外滋养层细胞单层培养模型。(3)利用不同浓度(OM.5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M.5×10-10M) 17β-E2作用BeWo细胞一定时间(1h、3h、6h、12h、24h)后,分别通过测定细胞跨上皮电阻(Transepithelial electrical resistance,TEER)和细胞旁渗透性的改变(Paracellular permeability,CPP)的改变,评估雌激素作用下滋养层紧密连接功能的改变。(4)确定处理BeWo细胞12小时的选择,该时间点作用BeWo细胞能最大程度反映雌激素处理细胞后改变。通过Western Blot检测紧密连接因子ZO-1、OCLN、CLDN3、CLDN4、CLDN5、CLDN8在不同浓度17β-E2处理12h后蛋白水平表达改变。(5)利用免疫荧光技术检测一定浓度的17β-E2处理BeWo细胞12h后紧密连接因子细胞定位的变化,研究雌激素对紧密连接功能改变的可能原因。(6)体外培养BeWo细胞,CCK-8实验检测不同浓度(0M、5×10-7M、5×10-8M. 5×10-9M、5×10-10M)17β-E2作用BeWo细胞12h后细胞活力改变,确定该条件的选择可以用于后续的BeWo细胞侵袭实验。(7)利用以上实验条件,细胞体外侵袭实验(Transwell Matrigel Invasion Assay)检测细胞侵袭能力的改变。并进一步通过Western Blot检测基质金属蛋白酶2和9 (MMP2、MMP9)的表达,探讨高雌激素导致滋养层细胞侵袭能力受损的可能原因。结果(1)妊娠早期的孕妇血清E2浓度[(3.44±1.30) nmol/L]低于足月妊娠孕妇[(509.78±197.82) nmol/L] (t=10.2, P<0.001);而孕早期绒毛组织中E2浓度[(30.82±13.91) pmol/mg]显著高于足月胎盘组织中E2浓度[(17.21±5.37) pmol/mg] (t=4.1, P<0.001)).(2)利用Millicell小室体外培养BeWo细胞,通过TEER测定和CPP分析评估不同浓度(OM,5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M.5×10-10M)雌激素对滋养层细胞作用不同时间后,对其紧密连接功能的影响。结果显示不同浓度17β-E2处理BeWo细胞1h和3h后,其TEER均无明显变化(P>0.05)；5×10"7M、5×10-8M的17β-E2处理BeWo细胞6h后,其TEER显著降低,CPP显著升高(P<0.05)；(3) 5×10-7、5×10-8M、5×10-9M的17β-E2处理BeWo细胞12h和24h后,其TEER显著降低,CPP显著升高(P<0.05)。其中在12h,17β-E2对BeWo的处理效应最为明显,且呈现一定的浓度依赖性。(4)不同浓度17β-E2作用BeWo细胞12h后Western Blot检测各紧密连接因子蛋白水平的表达,发现OCLN在5×10-7M、5×10-8M、5×10-9M雌激素水平表达量下调(P<0.05); CLDN3在5×10"7M、5×10-8M雌激素水平表达量下调(P<0.05)；其他紧密连接因子表达量无明显改变(P>0.05)。5×10-7M 17β-E2处理BeWo细胞12h后,免疫荧光结果显示OCLN和CLDN3表达量下调,CLDN5呈现出从胞浆转移至胞核的现象。(5)体外培养BeWo细胞,CCK-8实验检测不同浓度(0M、5×10-7M、 5×10-8M、 5×10-9M、5×10-10M) 17β-E2作用BeWo细胞12h,细胞活力没有明显改变(P>0.05)。(6)细胞体外侵袭实验显示仅5×10-7M、5×10-8M雌激素作用BeWo细胞12后,BeWo细胞侵袭能力下降；Western Blot结果显示同等条件下MMP2表达下调(P<0.05),MMP9无明显改变(P>0.05)。结论：(1)正常自然妊娠的早期绒毛组织中含有高浓度的E2,足月分娩时胎盘组织中E2相对较低。(2)本研究以BeWo细胞为模型,发现高水平雌激素可引起胎盘滋养层细胞紧密连接功能的破坏,提示ART促排产生的高雌激素水平可能会通过影响滋养层细胞间紧密连接结构进而影响胎盘功能的正常发挥。(3)高水平雌激素可以导致BeWo细胞侵袭功能受损,提示ART促排产生的高雌激素水平可能会影响滋养层细胞侵袭功能,导致胎盘功能异常,参与了妊娠期胎盘相关并发症的发生。(4)本研究的结果,为优化ART条件、提高ART技术安全性提供新的依据。