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主要组织相容性复合体(MHC)是有颌脊椎动物特有的基因群,编码一些细胞表面糖蛋白,识别、结合并呈递抗原多肽给T淋巴细胞,激发机体产生适应性免疫反应。MHC是至今为止发现的多态性最高的基因系统,又由于其与病原识别相关,因而是一个分子免疫学、分子生态学等领域极受关注的一个分子标记。MHC分子主要分为2类:class I和ClassⅡ,它们在结构和功能上存在一些差异。尽管不同动物的class I和ClassⅡ具有一些相同的分子进化特征,但随着脊椎动物的进化,它们也在发生变化。其中最显著的变化是,class I和ClassⅡ在软骨鱼类和四足类动物是连锁在一条染色体上,而在硬骨鱼类中则没有连锁。多鳍鱼、鲟鱼、雀鳝和弓鳍鱼在进化上处于辐鳍鱼类基部,是联系硬骨鱼类与软骨鱼类和四足类的中间类群,成为了解MHC分子进化历程的关键动物。本文以塞内加尔多鳍鱼(Polypterus senegalus)、中华鲟(Acipenser sinensis)、匙吻鲟(Polyodonspathala)和短吻雀鳝(Lepisosteus platostomus)等4种低等辐鳍鱼为材料,克隆并分析它们MHC class I和ClassⅡ B基因。在此基础上,以雀鳝科和鲟形目为代表,分析古代鱼MHC的分子进化模式。主要研究结果如下:
1),中华鲟和匙吻鲟MHC class I多态性高、有多座位及发生重组,而塞内加尔多鳍鱼和短吻雀鳝class I的多态性很低(第2章)。使用cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录PCR(RT-PCR)方法,分离得到塞内加尔多鳍鱼、中华鲟、匙吻鲟(Polyodon和短吻雀鳝class I序列分别是3、6、11和3条。这些序列都具有经典class I的序列特征,在系统发育结构上靠近硬骨鱼的经典class I,推测为经典的class I。中华鲟和匙吻鲟MHC class I核苷酸和氨基酸序列都表现高变异性,并发生跨种多念性,已经受到正向选择作用。根据系统发育分析和个体分离得到的等位基因数,推测中华鲟和匙吻鲟至少有2个以上的class I座位。重组检验显示,中华鲟和匙吻鲟class I具有较高的重组率,并找到4条重组序列。与之相对,塞内加尔多鳍鱼和短吻雀鳝的class1只有少数几个序列变异。
2),塞内加尔多鳍鱼、中华鲟和匙吻鲟MHC classⅡ B多态性高、有多座位及发生基因重组(第3章)。我们克隆得到塞内加尔多鳍鱼、中华鲟和匙吻鲟MHC classⅡ B序列分别是15、8和11条,这些序列具有classⅡ B基因的序列特征,除了中华鲟和匙吻鲟缺乏典型的糖基化位点。塞内加尔多鳍鱼、中华鲟和匙吻鲟β1区核苷酸多态位点比例分别是22.58％、24.91％和8.77％,氨基酸多态位点比例分别是40.86％、45.26％和15.79％。正向选择检验显示,这3种鱼β1区的dN/dS>1,中华鲟和匙吻鲟分别鉴定出15和2个正向选择位点,但塞内加尔多鳍鱼没有发现正向选择位点。系统关系上,4种古代鱼与硬骨鱼的classⅡ B序列聚在一起形成辐鳍鱼类分支,其中中华鲟和匙吻鲟位于基部,而短吻雀鳝夹于硬骨鱼类中。根据序列特征及系统发育网络,推测塞内加尔多鳍鱼和匙吻鲟知道有3个classⅡ B、中华鲟至少有5个座位。重组检验显示,塞内加尔多鳍鱼和中华鲟分别找到2和1条重组序列。
3),雀鳝科鱼类MHC class I序列变异小、缺乏重组、跨种多态性仅限于属内。设计雀鳝目class I特异引物,从雀鳝目2属5种共14尾鱼cDNA中扩增classI基因,共分离得到18个等位基因。序列变异分析显示,大雀鳝属10条class I序列只有29个核苷酸和18个氨基酸变异位点。雀鳝属8条序列有153个核苷酸和79个氨基酸变异位点,但是α3区变异比α1和α2区更大。α1和α2区检测到正向选择作用,而α3区没有。系统发育分析显示,大雀鳝属和雀鳝属具有不同分支,但各自内部不同种的序列没有分开,说明跨种多态性仅限于属内。重组检验表明,雀鳝class I没有发生重组。
4),鲟形目鱼类的MHC class I和ClassⅡ B都具有多座位、高多态性的特点,但在跨种多态性、等位基因谱系进化和重组率上存在差异。利用单链构象多态性(SSCP)对14种鲟形目鱼类的MHC class I的α1、α2和ClassⅡβ1、β2等4个结构区分型,结果显示每种鲟科鱼类α1区有35条以上、β1区约8-12条,匙吻鲟科α1区有6-15条以上、β1区约6-8条,暗示鲟科鱼类至少有8个class I和4个ClassⅡ B座位,匙吻鲟科至少有4个class I和3个ClassⅡ B座位。鲟形目MHCα1、α2、β1、β2氨基酸多态性位点比例为87.7％、81.3％、64.9％、35.2％,表现为高度多态性。系统发育分析显示鲟形MHC class I呈现目内跨种多态性,而classⅡ B为属内跨种多态性。在系统发育网络上,class I等位基因谱系间呈哑铃型结构,而classⅡ B呈星型结构。这4个结构区都没有检测到重组信号,但β1、β2区具有比突变率高的重组率,而α1、α2相反。这些差异提示鲟形目class I和ClassⅡ B具有不同的进化历程。