论文部分内容阅读
利福霉素是由地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)产生的一类安莎大环内酯类抗生素,广泛应用于治疗革兰氏阳性菌以及与结核病、麻风病和艾滋病等有关的分枝杆菌感染,已于上世纪六十年代初应用于临床。目前利福霉素的工业化生产主要以利福霉素B和SV为主,本文对涉及利福霉素SV的菌种选育后技术及发酵过程代谢调控的多个方面进行了研究。
遗传育种的后技术包括防止优良菌株被漏筛、提高筛选效率的相关技术和方法以及得到高产菌株后进行工业发酵生产过程优化与放大所需要的一系列理论与方法。
通过推理选育和定向筛选,得到了抗反馈抑制高产菌株和产物耐受高产菌株;并在此基础上利用双亲株灭活融合法成功地将利福霉素B产生菌X-1#和利福霉素SV产生菌U-32进行融合,筛选到了两株高产融合菌株,最高者效价增幅达48%。基于pH摇床应用,建立了一种以发酵前期(约50h)pH的变化为判断依据的菌种快速初筛方法,依据此方法获得的菌株中高于出发菌株的概率接近70%。
利用pH摇床对种子的培养过程进行了研究,发现种子最适接种量为6~8%(v/v)、最适移种时机为对数生长期末期。并建立了种子培养过程的菌浓预测模型,该模型能够较准确地预测对数生长期及移种时菌浓。
通过对有机氮源的研究发现,鱼粉是影响发酵的最主要因素,并得到了三种主要有机氮源的优化配方;另外,在无机氮源中少量的硫酸铵替代部分硝酸钾有利于产物的合成,二者的最适添加量分别为0.2%和0.7%。
对影响利福霉素SV生物合成的因素进行了研究,发现甘油作为利福霉素合成的三碳前体能够促进利福霉素的合成,并通过有机酸分析发现甘油的加入促进了三碳前体的供应;维生素C作为一种有效的抗氧化剂能够起到防止利福霉素SV氧化的作用,添加量为0.05%时促进产素作用最明显;Mg2+是利福霉素SV合成的两个关键酶谷氨酰铵合成酶(GS)和甲基丙二酰CoA消旋酶(MCR)的激活剂,添加浓度为0.005~0.01%时能够明显促进利福霉素的合成;聚丙二醇在利福霉素发酵过程中表现出很强的促进产素的效果,并得到了最优的补加策略。
对利福霉素SV发酵过程基本特征进行了研究,发现产物的生成与菌体生长基本不关联;葡萄糖比消耗速率(Qs)和产物比生成速率(Qp)之间呈正相关关系,在后期保持高的Qs将有利于产素。
研究了发酵环境因素的影响,发现利福霉素SV在摇瓶培养中以28℃最为适宜;而在发酵罐培养中采取变温培养更有利于产物的形成。溶氧的水平对发酵的影响较为显著,产素期溶氧水平控制在25~40%较为适宜;而利福霉素产生菌对剪切并不敏感。
建立了新的补糖策略,即前期采取较低的初糖浓度(3%),发酵过程控制较低的残糖指标1~2%。并通过比较原始工艺及新的补糖工艺下的代谢流分布的变化,发现新的补糖工艺下TCA代谢通量和芳香核的N供应前体imino-E4P的合成速率得到了加强,从而促进了利福霉素的合成。