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运用RT—PCR的方法,将分离自中国的狂犬病病毒街毒株HN10的全基因组分为24个片段进行分段扩增并测序,然后再将测序结果拼接成全长基因组序列,通过进化关系分析、同源性分析以及编码蛋白结构的分析研究HN10株与中国其他狂犬病病毒街毒株的关系以及与多种疫苗株的关系。狂犬病病毒街毒株HN10的基因组结构非常保守,在进化关系上与分离自广西、湖南的街毒株以及中国减毒疫苗株CTN181株相近,结构蛋白上的功能区域大都保守存在,与CTN181株不论在核苷酸同源性还是在分子结构上都比其他的疫苗株更为接近。
在HN10株全基因组序列测定的基础上,利用分子克隆的方法,将其全基因组分为4个片段按照它们在基因组上的顺序依次克隆到真核表达载体pVAX1上,并将G—L间隔区的非编码区替换为表达绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸,构建出表达GFP的重组狂犬病病毒HN10株全长基因组cDNA真核表达质粒,同时,在全长cDNA的两侧嵌入锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)的序列,并置于CMV启动子的控制下,构建出全长cDNA真核表达质粒。
同样利用分子克隆的方法将HN10的N、P、G和L基因分别克隆到真核表达载体pVAX1上,构建出4个cDNA真核表达质粒,这些质粒即狂犬病病毒反向遗传系统所需的辅助质粒。
构建出所需的全长基因组真核表达质粒和编码N、P、G和L蛋白的四个辅助质粒后,将它们以一定的比例共同转染BHK—21细胞和MNA细胞,通过DFA试验和RT—PCR试验证实所拯救出的狂犬病病毒即为重组的狂犬病病毒,表明已成功建立了狂犬病病毒街毒株的反向遗传系统。