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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,给全球的养猪业造成了巨大的经济损失。目前为止,由于非洲猪瘟病毒的特殊性,还未生产出能提供有效保护的疫苗以及有效的治疗药物,给非洲猪瘟的防控工作带来了极大的挑战。因此,本研究以大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基（LTB）作为佐剂,与非洲猪瘟病毒CD2v蛋白和p49蛋白共同构建重组核酸疫苗与亚单位疫苗,并评价其免疫原性,对于非洲猪瘟疫苗的研发具有重要的理论和实践意义。1.重组核酸疫苗选取非洲猪瘟结构蛋白CD2v、p49通过PCR与LTB片段连接至pc DNA3.1（-）表达载体,构建了pc DNA3.1-CD2v、pc DNA3.1-p49、pc DNA3.1-CD2v+LTB、pc DNA3.1-p49+LTB 4种重组核酸疫苗。首先通过双酶切和测序验证重组质粒构建正确。为了验证重组真核表达载体能否进行转录表达,通过转染哺乳动物细胞进行体外实验,通过Western Blot的方法对添加的His标签检测,观察到符合预期蛋白大小的特异性条带。提取无内毒素质粒接种小鼠,通过对小鼠外周血检测,进行效价评估。pc DNA3.1-CD2v组、pc DNA3.1-p49组、pc DNA3.1-CD2v+LTB组和pc DNA3.1-p49+LTB组在28 d和42 d后都抗体Ig G水平显著升高（P＜0.01）,28d时pc DNA3.1-CD2v和pc DNA3.1-CD2v+LTB组之间差异显著（P＜0.05）。用CD2v蛋白和p49蛋白作为检测抗原包被ELISA板,进行抗体效价的评估,发现注射pc DNA3.1-CD2v质粒的小鼠血清效价大约为1:12800,pc DNA3.1-CD2v+LTB质粒的小鼠血清效价大约为1:25600,pc DNA3.1-p49质粒的小鼠血清效价大约为1:6400,pc DNA3.1-p49+LTB质粒的小鼠血清效价大约为1:12800。检测重组核酸疫苗对T淋巴细胞的刺激作用,结果显示pc DNA3.1-CD2v、pc DNA3.1-p49、pc DNA3.1-CD2v+LTB、pc DNA3.1-p49+LTB的CD4+/CD8+比值分别为2.619、2.487、5.567、3.42,空载体pc DNA3.1（-）和PBS组的为1.976、1.780。检测重组质粒接种小鼠后对细胞因子水平的影响,研究表明在INF-γ和IL-2水平的检测中,相较对照组,实验组pc DNA3.1-CD2v、pc DNA3.1-p49、pc DNA3.1-CD2v+LTB、pc DNA3.1-p49+LTB均表现较高水平增长,且pc DNA3.1-CD2v+LTB组相比较pc DNA3.1-CD2v组,INF-γ和IL-2水平增长显著（P＜0.05）,pc DNA3.1-p49+LTB组和pc DNA3.1-p49组相比,IL-2水平增长显著（P＜0.05）。在IL-4水平的检测中,与对照组相比,pc DNA3.1-CD2v和pc DNA3.1-p49+LTB组增长显著（P＜0.05）,pc DNA3.1-CD2v+LTB组增长极显著（P＜0.01）,但是pc DNA3.1-CD2v,pc DNA3.1-CD2v+LTB组间和pc DNA3.1-p49,pc DNA3.1-p49+LTB组间均无显著差异（P＞0.05）。2.重组亚单位疫苗将扩增得到的目的基因p49和LTB连接到p PIC9K质粒上,构建重组酵母表达载体p PIC9K-p49和p PIC9K-p49+LTB,首先通过双酶切和测序验证重组质粒构建正确。将重组质粒通过电转的方式转入甲醇诱导型毕赤酵母中,将筛选得到的阳性菌株,提取基因组,并质粒PCR验证。挑选阳性菌株,诱导表达后用Western Blot的方法对添加的His标签进行检测,挑选出能正确蛋白的菌株继续扩培诱导,大量发酵得到目的蛋白并通过His标签进行纯化。将纯化的重组蛋白p49、p49+LTB和LTB配合弗氏佐剂以及弗氏不完全佐剂腹腔注射小鼠,免疫14 d,28 d和42 d后,p49组和p49+LTB组与对照组PBS相比,抗体Ig G水平都显著增加（P＜0.01）。且p49和p49+LTB组之间差异极显著（P＜0.01）。以p49蛋白作为检测抗原包被ELISA板,进行抗体效价的评估,发现接种p49蛋白的小鼠血清效价大约为1:25600,接种p49+LTB蛋白的小鼠血清效价大约为1:102400。检测重组亚单位疫苗对T淋巴细胞的刺激作用,结果显示p49、p49+LTB和LTB组的CD4+/CD8+比值分别为3.191、5.288、2.487,明显高于PBS组的1.700,结果表明接种疫苗后使小鼠外周血CD4+淋巴细胞的比例增加。进一步检测重组蛋白接种小鼠后是否相起细胞因子水平发生改变。取免疫后42d小鼠血清进行ELISA实验,在IL-2、IL-4和INF-γ和水平的检测中,实验组p49、和p49+LTB较对照组均表现较高水平增长（P＜0.01）。p49组相比较p49+LTB组,其中INF-γ和IL-2水平增长显著（P＜0.01）,而IL-4水平差异不显著（P＞0.05）。以上结果表明,本研究所构建的重组核酸疫苗和重组亚单位疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激机体产生特异性抗体,并激活相应的细胞和体液免疫应答,而LTB作为佐剂能够显著提高机体的免疫水平,为非洲猪瘟疫苗的研究开发提供一种技术思路。