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原发性支气管肺癌（以下简称肺癌）是目前最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居各种癌症之首。近三十年，尽管不断有新的治疗方法出现，但是肺癌的5年总体生存率依然没有明显的变化[1]。肺癌的转移是疗效难以进一步提高的主要原因，因此肿瘤转移机制的研究目前仍然是各国学者共同关注的焦点。在肿瘤组织中存在大量活化性质的巨噬细胞。以前的研究认为，在肿瘤发生和发展的过程中，免疫细胞主要参与抗肿瘤免疫[2]。然而，广泛的临床和实验证据显示浸润性免疫细胞通过促进肿瘤细胞侵袭和迁移，血管生成和淋巴管生成以及抑制抗肿瘤免疫应答来支持肿瘤进展起主要作用[3]。巨噬细胞在肺癌微环境中释放细胞因子、炎症因子并促进肺癌细胞的侵袭和转移。我们采用肺癌细胞与肿瘤相关巨噬细胞共培养模型的体外模型等研究技术，观察肿瘤相关巨噬细胞及巨噬细胞活化的M2型巨噬细胞的作用以及对上皮间质转化的影响，从而探索肺癌微环境中巨噬细胞及其相关细胞因子和炎症因子促进肿瘤转移的相关机理。 因此，课题在“扶正抗癌”的理论指导下，从温里药入手，探研温阳扶正法抗肿瘤作用和机理。通过对温里药附子、肉桂、干姜、高良姜、丁香、小茴香、花椒、吴茱萸、胡椒、荜茇、荜澄茄进行体内抑瘤筛选，发现附子、吴茱萸、荜茇有较好的抑瘤作用，进一步筛选上述三味中药的单体成份发现，荜茇的主要成份荜茇明碱对肺癌微环境中的巨噬细胞有明显调节作用。因此，课题对荜茇及其主要组分荜茇明碱作了深入研究。研究结果显示，温里药荜茇及其组分荜茇明碱不仅具有较强的抑瘤作用，其通过调控肺癌微环境中的巨噬细胞表型进而抑制肺癌上皮间质转化是其抗肿瘤的主要机制之一，从而为温阳扶正抗癌理论与实践提供依据。 第一部分温里药对肿瘤抑制作用的筛选及其有效成分对肿瘤的抑制作用 目的:根据《中药学》第五版，将温里药附子、肉桂、干姜、高良姜、丁香、小茴香、花椒、吴茱萸、胡椒、荜茇、荜澄茄进行筛选，选出温里药中对Lewis小鼠具有抑瘤作用的温里药，并通过数据库筛选出肿瘤的有效成分，为下一步实验奠定基础。 方法:构建Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤模型，将附子、干姜、高良姜、丁香、小茴香、花椒、吴茱萸、胡椒、荜茇、荜澄茄灌胃21天后，观察其抑瘤效果。 结果:1.附子、吴茱萸、荜茇对肿瘤具有抑制作用，与对照组相比，附子、吴茱萸、荜茇对肿瘤具有抑制效果，可以抑制Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤的生长，差异有统计学意义，(p＜0.05)。2.乌头碱60μM于24h对肺癌细胞的抑制作用开始起效，A549IC50为27.36μM，H1299为24.51μM;吴茱萸碱40μM于24h开始对肺癌细胞抑制作用开始起效，A549IC50为13.25μM，H1299为14.51μM;荜茇明碱5μM于24h开始对肺癌细胞抑制作用开始起效，A549IC50为2.41μM，H1299为3.12μM。 结论:温里药中的附子、吴茱萸、荜茇对Lewis肺癌小鼠皮下移植瘤有抑制作用，荜茇可抑制肿瘤组织中CD206的表达;其中的主要生物碱成分乌头碱、吴茱萸碱和荜茇明碱可以抑制肺癌细胞株的转移。 第二部分 M2型肿瘤相关巨噬细胞的体外诱导活化模型的建立和温里药单体筛选 目的:建立肿瘤相关巨噬细胞的体外诱导活化模型，找出最佳诱导时间，并在具有抗肿瘤作用的单体成分乌头碱、吴茱萸碱、荜茇明碱中筛选出具有调节肿瘤相关巨噬细胞表型的单体成分。 方法:通过流式细胞术和Westernblot法检测活化的两种主要的肿瘤相关巨噬细胞表型表面标志物的测定，进一步流式细胞术筛选出具有调节肿瘤相关巨噬细胞表型的单体成分。 结果:通过研究发现，采用体外诱导的方法，对两种亚型的巨噬细胞进行LPS和IL-4的体外诱导，建立体外活化的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞模型。进一步，在温阳药中的三个具有抗肿瘤作用的单体成分中，发现荜茇明碱具有明显降低M2型标记物的作用。 结论:巨噬细胞的分型可以通过体外诱导的模式建立，荜茇明碱可以扭转M2的极化表型。 第三部分 M2型肿瘤相关巨噬细胞来源的IL-6、TGF-β1对肺癌细胞转移的影响和其分子机制研究 目的:炎症因子和细胞因子是肿瘤相关巨噬细胞为主的微环境中的重要因子，大量实验报道肿瘤微环境中的各种因子存在着复杂的影响因素，其中IL-6，TGF-β1是M2型肿瘤相关巨噬细胞分泌的特征性因子。为验证肿瘤相关巨噬细胞的分泌因子的相互作用关系，我们设置了不同的时间进行观察，并对荜茇明碱抑制肿瘤相关巨噬细胞上清的分泌成分进行了进一步的观察，为后续进一步分子机制的探索提供思路。 方法:同过ELISA的实验方法对诱导的M2型巨噬细胞上清分泌物IL6、TGF-β1进行检测，再通过QPCR进行基因层面的验证。采用IL-6中和抗体，验证IL-6和TGF-β1的相互作用关系。探讨荜茇明碱是否可以抑制肿瘤相关巨噬细胞来源的IL-6的分泌。 结果:(1) M2型巨噬细胞分泌的IL-6在第12h达到最大值(p＜0.05)(2)IL-6分泌增加可以继续促进巨噬细胞TGF-β1的分泌增加(3)采用IL-6抗体，肿瘤相关巨噬细胞分泌的IL-6减少，同时TGF-β的分泌也相应减少。(p＜0.05)(4)荜茇明碱可以抑制肿瘤相关巨噬细胞分泌的IL-6(5) QPCR验证IL-6增强TGF-β的表达水平，可以增强上皮间质转化的发生。 结论:IL-6和TGF-β1是肿瘤相关巨噬细胞的上清液中分泌的主要细胞因子，在肿瘤微环境中存在相互作用，IL-6可以促进TGF-β的分泌，但并不影响下游上皮间质转化的发生。 第四部分荜茇明碱抑制TGF-β1/Smad信号通路在肿瘤相关巨噬细胞介导肺癌细胞的侵袭转移中和上皮间质转化中的机制 目的:研究肿瘤相关巨噬细胞介导的肺癌细胞上皮间质转化的发生的作用机理和信号通路。并对荜茇明碱通过抑制TGF-β1/Smad信号通路抑制肿瘤相关巨噬细胞上皮间质转化的机理进行的研究 方法:采用划痕实验、克隆形成实验、transwell实验对共培养条件下的肺癌细胞的转移能力，增殖能力，侵袭能力进行检测，Westernblot实验检验TGF-β1/Smad信号信号通路进行检测，采用TGF-β抑制剂验证过度分泌TGF-β1/Smad信号通路是发生上皮间质转化的主要途径。 结果:荜茇明碱可以抑制TGF-β1，p-samd2，p-samd3蛋白，从而抑制上皮间质转化的E-Cadherin、Snail、twist蛋白的表达 结论:荜茇明碱对TGF-β1信号转导通路起到负向调节作用，荜茇明碱可以使共培养体系中的肿瘤细胞对TGF-β1的敏感性降低。 第五部分荜茇明碱通过调节肿瘤相关巨噬细胞对小鼠Lewis肺癌模型上皮间质转化的作用 目的:采用体内实验，建立LLC小鼠肺癌移植瘤模型，观察荜茇明碱对LLC小鼠的抑瘤作用。观察肿瘤相关巨噬细胞在瘤块中的表达，并验证TGF-β1/Smad信号通路在瘤块中的表达和上皮间质转化在瘤块中的发生情况。验证荜茇明碱在瘤块中通过TGF-β1/Smad信号通路，引起上皮间质转化的发生。 方法:建立Lewis肺癌小鼠移植瘤模型，同时注射共培养的肺癌细胞株，同时观察体内的荜茇明碱的抑瘤能力，采用免疫组化的方法验证肿瘤内TGF-β/Smad信号通路的异常导致上皮间质转化的发生。 结果:体外共培养的Lewis在小鼠体内成瘤速度更快。同时采用荜茇明碱20mg/kg可以抑制Lewis小鼠肿瘤的生长。与对照组相比，差异有统计学意义，P＜0.05。 结论:M2共培养的肿瘤细胞在C57小鼠体内的生长速度更快，荜茇明碱可以抑制小鼠肿瘤内M2的表达，减低瘤块内TGF-β1/Smad信号通路上蛋白的表达，从而抑制了小鼠体内上皮间质转化的发生。 结论： (1)本实验以“温阳扶正”为理论基础，从温里药中筛选出附子、吴茱萸、荜茇三味中药对Lewis小鼠肺癌具有抑制作用。 (2)通过生物信息学的方法，从数据库中筛选出附子、吴茱萸、荜茇三味中药中的单体抗肿瘤有效成分乌头碱、吴茱萸碱、荜茇明碱，并进行抑瘤率的验证。 (3)体外成功诱导了RAW264.7巨噬细胞的M1亚型和M2亚型，并从小鼠骨髓中培养出原代巨噬细胞(BMDM)进行成功诱导。 (4)从乌头碱、吴茱萸碱、荜茇明碱出筛选出具有改变M2型肿瘤相关巨噬细胞的表型的荜茇明碱。 (5) M2型巨噬细胞与肺癌细胞微环境中的IL-6可以促进TGF-β1的分泌，形成促进肿瘤生长的炎性微环境。 (6)通过体内和体外实验，证明荜茇明碱抑制TGF-β1/Smad信号通路，并进一步抑制肺癌细胞上皮间质转化的能力，最终发挥其抑制肺癌转移、增殖、侵袭的潜能。