论文部分内容阅读
RuvBL1属于AAA+超家族成员，是ATP结合蛋白，与细菌RuvB解旋酶同源，具有ATP酶和解旋酶活性。RuvBL1与其他蛋白共同组成蛋白质复合体，参与多种细胞活动，包括染色体重塑、基因转录调控、DNA损伤修复、snoRNP组装等。近来研究报道RuvBL1在肝癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤细胞中均过度表达，能与c-myc和β-catenin等肿瘤相关基因产物相互作用，参与细胞转化和癌症转移。RuvBL1参与肿瘤相关基因在转录调控的作用机制仍有待阐明，这是一个值得探索的课题。本研究中，我们以RuvBL1对AP-1转录活性的影响为切入点，阐明RuvBL1作为转录辅助因子参与转录调控可能发挥的生物学作用。AP-1是肿瘤发生过程中重要的转录因子，主要是由Jun、Fos、ATF和MAF家族蛋白组成，识别TPA应答元件(TRE)。细胞应答多种信号刺激如细胞因子、生长因子、压力等都能够激活AP-1，启动靶基因的转录，调控细胞行为包括增殖、分化、凋亡、细胞迁移和细胞转化，对肿瘤的形成、转移和侵袭至关重要。 首先，我们通过测报告基因活性实验，确定了RuvBL1表达能够抑制AP-1转录激活并呈剂量依赖型，以及EMSA实验进一步确定RuvBL1还能够抑制AP-1的DNA结合能力。接着，采用RNA干扰技术敲减内源性RuvBL1，此时AP-1转录活性提高，DNA结合能力也有所增强，并且激活了下游靶基因c-Jun的表达。这些发现表明了RuvBL1可能是AP-1转录活性的负调控因子。 为了确定RuvBL1抑制AP-1活性的作用途径，我们从胞质MAPK通路激活开始检测，采用TPA刺激细胞激活AP-1活性，通过Western B1ot分别测定ERK、P38和JNK的激活变化。结果显示，RuvBL1对MAPK通路激活的变化影响不明显，对c-Jun和c-Fos的磷酸化激活的影响也不显著，暗示了RuvBL1对AP-1的抑制作用可能来自于胞核的转录调控。 c-Jun是AP-1转录复合物的主要成分之一，可以形成c-Jun/c-Jun或c-Fos/c-Jun复合物启动转录。当过表达c-Jun激活AP-1转录活性时，通过EMSA和报告基因活性检测两个实验，我们发现RuvBL1的表达能直接抑制c-Jun介导的AP-1转录活性，也可以阻止c-Jun/AP-1蛋白与DNA的结合活性。那么，RuvBL1抑制AP-1转录活性的分子机制是什么呢？据报道，Wnt通路与JNK存在交叉激活，而且c-Jun与β-catenin/TCF4之间存在相互作用，并且依赖于β-catenin的存在。而RuvBL1与β-catenin相互作用，是β-catenin的辅助因子，这使得我们有兴趣去猜测RuvBL1是否通过竞争结合β-catenin从而影响AP-1的转录活性？通过Co-IP实验，我们发现RuvBL1过表达能阻碍β-catenin与c-Jun之间的相互作用，并且通过Ch-IP实验技术进一步确定RuvBL1抑制了β-catenin和c-Jun复合物与启动子结合元件的结合。最后，通过报告基因检测实验，我们验证了上述的现象，RuvBL1能够抑制β-catenin/wnt通路介导的AP-1转录激活。 AP-1活性与细胞凋亡和细胞增殖密切相关，RuvBL1对AP-1活性的影响是否参与细胞的生死呢？为了探讨RuvBL1可能的生物学活性，我们选择了Jurkat T细胞为实验材料，因为AP-1对T细胞增殖与凋亡的调控作用尤为关键，并且RuvBL1蛋白表达谱表明它在T淋巴瘤细胞中表达很高。采用依托泊苷诱导Jurkat T细胞凋亡时，我们检测到JNK激活，AP-1/c-Jun参与其中发挥促凋亡作用。于是，通过电转RuvBL1表达质粒后，我们进行了凋亡检测，结果发现RuvBL1能够保护细胞抵制依托泊苷诱导的细胞凋亡，这与我们之前的发现RuvBL1抑制AP-1活性结果相一致。这些研究发现为RuvBL1在细胞转化中的提供了新的见解，为靶向RuvBL1的肿瘤治疗的可能性提供理论依据，为扩宽疾病的治疗思路和途径提供新的切入点。