胸腺体液因子和血清胸腺因子的合成及活性研究

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胸腺素类制剂在抗感染、抗肿瘤和自身免疫性疾病中起着重要作用。胸腺因子大多数都作用于T淋巴细胞,促进其分化成熟,但也有各自的特性。胸腺体液因子(ThymicHumoralFactor-γ2,THF-γ2)和血清胸腺因子(Thymulin,FTS)是两种重要的胸腺素。THF-γ2调节CD4+/CD8+T细胞比率,增强脾细胞对有丝分裂原的反应,T细胞对凝集素的增殖反应,T细胞对抗体产生的辅助作用,移植抗宿主反应和细胞毒反应等多种特性。THF-γ2也刺激IL-2和TNFα的产生,以及提高胸腺细胞的抗肿瘤活性。FTS已经被证明影响CD4+/CD8+T细胞比率,增加自然杀伤细胞(NK)的活力,增加抗体的产生,增加白介素-2受体和干扰素-γ受体的表达。本文旨在建立THF-γ2和FTS的合成、纯化和分析方法,研究其生物活性,为应用开发奠定基础。 本实验首先建立了氨基酸保护的方法,对所需氨基酸的氨基和活性侧链进行了成功的衍生。合成了Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH。并经薄层层析,紫外扫描,熔点测定和HPLC分析得以确证。同时制备了载量适中的氨基酸与树脂的偶联产物Fmoc-Leu-Wang和Fmoc-Asn(Trt)-Wang树脂。 采用Fmoc固相合成法(SPPS)合成了THF-γ2,用中压液相反相柱一步纯化,经HPLC分析纯度,通过质谱、氨基酸组成和序列分析鉴定合成产物。根据THF-γ2促进T细胞产生IL-2的特性检测合成产物的体外活性。结果表明:化学合成胸腺体液因子的产率为95.8%;纯化后其纯度达到95.92%;质谱测定其分子量为918,与理论分子量相符;氨基酸序列测定为NH2/Leu-Glu-Asp-Gly-Pro-Lys-Phe-Leu,与设计序列一致;当THF-γ2浓度为300ng/ml时,小鼠脾细胞产生IL-2的浓度最高,为空白对照的1.9倍。 采用Fmoc固相合成法合成了FTS,用中压液相阴离子柱一步纯化,经HPLC分析纯度,通过质谱、氨基酸组成和序列分析鉴定合成产物。由FTS恢复胸腺切除小鼠的脾细胞对免疫抑制剂AZ敏感的特性测定合成FTS的活性。结果表明:化学合成血清胸腺因子的产率为94.7%;纯化后其纯度为93.7%;质谱测定其分子量为876.6,与理论分子量相符;氨基酸序列测定为NH2/Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn,与设计序列一致;合成FTS的浓度低至10-14mol/l时尚有部分活力,在10-13mol/l时能够完全恢复胸腺切除小鼠的脾细胞对AZ的敏感性。 THF-γ2和FTS的生物活性有紧密的联系,两者的协同作用可能更好的调节免疫反应。嵌合肽能确保它们在同一时间出现在机体的同一部位。因此我们合成了两者的嵌合肽,经纯化和分析鉴定之后,用绵羊红细胞实验,辐射保护实验和IL-2产生实验检测其活性。 发现由Ala-Tyr-Ala连接的嵌合肽FTS-THF-γ2(a)显示了FTS和THF-γ2的生物活性,成为一种新的潜在的免疫调节剂。 初步探索了FTS和THF-γ2作为放、化疗辅助用药的可能性。实验显示FTS提高了受辐射小鼠的免疫指标:白细胞总数和吞噬细胞能力都得到提高,胸腺指数也有所升高。FTS也提高了小鼠的存活率和存活时间。而在降低化疗副作用中,FTS和THF-γ2都显示了阳性结果,提高了荷瘤小鼠注射环磷酰胺后的存活率和存活时间。 本论文也包括了一种蛇毒抗凝肽(Hannahpep)的合成和体外活性测定,实验表明Hannahpep确有溶纤维蛋白和纤维蛋白原的活性。
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