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目的：
评价补肾解毒通络法（BushenJieduTongluoMethodBSJD）治疗复发/难治性急性白血病（AcuteleukemiaAL）的临床疗效，探讨补肾解毒通络法调控骨髓微环境防止复发/难治性AL复发的作用机制研究。
方法：
研究一，收集2013年5月到2019年3月于天津中医药大学第一附属医院血液科住院治疗且分别符合急性髓细胞白血病（AcutemyeloidleukemiaAML）、急性淋巴细胞白血病（AcutelymPhoblasticleukemiaALL），骨髓增生异常综合征（MyelodysplasticsyndromeMDS）继发AML诊断标准的复发/难治性AL患者，依据补肾解毒通络使用与否分为西药对照组，补肾解毒通络组（西药＋补肾解毒通络组），非补肾解毒通络组（西药+非补肾解毒通络组），应用卡方检验比较三组化疗疗效，有效率、生存期情况。研究二，采用健康C57小鼠32只，经射线照射与否（IR±），随机分为4组。正常对照组（IR-NS），模型照射组（IR+NS），补肾解毒通络组（IR-BSJD），补肾解毒通络照射组（IR+BSJD），每组8只。照射组予5Gyγ射线照射后，分别予相应药物连续灌胃28d后脱颈处死小鼠，分离骨髓单个有核细胞进行原代培养，计数各组骨髓有核细胞及粒、巨噬细胞克隆形成单位（Colony-formingunit-GranulocyteMacrophageCFU-GM），成纤维细胞克隆形成单位（Colony-formingunitFibroblastCFU-F）；各组骨髓间充质干细胞（MesenchymalstemcellsMSCs）传至3~4代，再分别与K562白血病干细胞共培养24h后，经CCK-8检测各组K562细胞及K562对照组（K562白血病干细胞单独培养组）细胞增殖，FCM检测细胞凋亡、周期。研究三，补肾解毒通络法作用后的MSCs与K562白血病干细胞共培养24h后，经Elisa检测各组培养液上清IL-8分泌水平，qRT-PCR检测与K562白血病干细胞共培养前、后MSCs的Ang-1、CXCL12、Jagged-1、SCF基因表达。
结果：
1.87例复发/难治性AL患者，补肾解毒通络组33例：完全缓解（CompleteremissionCR）48.5%（16/33），部分缓解（PartialremissionPR）24.2%（8/33），未缓解（Non-remissionNR）27.3%（9/33），总有效率72.7%（24/33）；非补肾解毒通络组29例：CR17.2%(5/29)，PR38%（11/29），NR44.8%（13/29），总有效率55.2%（16/29）；西药对照组25例：CR32%（8/25），PR24%（6/29），NR44%（11/29），总有效率56%（14/29）。三组CR率和总有效率无统计学差异（P=0.116＞0.05）。
2.对87例患者随访观察，补肾解毒通络组33例患者中，生存期≤1年30.3%（10/33）、1＜生存期≤3年33.3%（11/33）、生存期＞3年36.3%（12/33）；非补肾解毒通络组：生存期≤1年44.8%（13/29）、1＜生存期≤3年48.3%（14/29）、生存期＞3年6.9%（2/29）；西药对照组，生存期≤1年56%（14/25），1＜生存期≤3年36%（9/25）、生存期＞3年8%（2/25）。三者长期存活率比较分析有差异(P=0.02＜0.05)。补肾解毒通络组能明显延长患者生存期：补肾解毒通络组对比西药对照组，P=0.024＜0.05；补肾解毒通络组对比非补肾解毒通络组，P=0.020＜0.05。
3.培养中K562细胞CD45+/CD33+白血病干细胞占总细胞95.3%，镜下细胞表面呈瘤状突起，核仁多。小鼠骨髓分离有核细胞：IR-NS：4.7×107个/ml，IR+NS组：4.0×107个/ml，IR-BSJD组：5.6×107个/ml，IR+BSJD组：4.8×107个/ml。IR-BSJD组和IR+BSJD组骨髓有核细胞数均高于IR-NS组和IR+NS组。CFU-GM：IR-NS组：31.67±2.03个，IR+NS组：29±3.46个，IR-BSJD组：40.67±1.45个，IR+BSJD组：36.33±1.86个，IR-NS组与IR-BSJD组比较具有统计学意义（P=0.0226＜0.05）。MSCs镜下示单层贴壁细胞，呈梭形紧密排列，CFU-F：IR-NS组：41.33±2.33个，IR+NS组：22.33±1.45个，IR-BSJD组：48±2.08个，IR+BSJD组：27.67±1.76个。IR-BSJD组和IR+BSJD组克隆数均高于IR-NS组和IR+NS组，但统计学无明显差异（P=0.1，0.0799）；组内有明显差异：IR-NS组和IR+NS组比较：P=0.0023＜0.05，IR-BSJD组与IR+BSJD组相比P=0.0017＜0.05，差异有统计学意义。
4.与其他共培养组相比，K562对照组CCK8的OD值均明显增高，IR-BSJD组与IR-NS组比较有统计学差异（P=0.0178＜0.05）。K562对照组中处于G0/G1细胞与其他共培养组比较，不具有统计学意义（P=0.935＞0.05），余各组之间未见明显差异。K562对照组细胞凋亡率与其余各组比较，未见明显差异（P=0.797＞0.05）。
5.MSCs分泌IL-8水平，共培养各组与MSCs对照组、K562对照组比较明显升高，差异具有明显统计学意义（P＜0.05）。辐射损伤小鼠中BSJD组与NS组对比MSCs表达Ang-1、CXCL12、Jagged1、SCF四种基因水平明显上调。各组与K562白血病干细胞共培养后，CXCL12、Jagged1、SCF表达均下调，Ang-1表达则上调，BSJD组和NS组相比，四种基因表达水平明显上调。
结论：
1.补肾解毒通络法治疗复发/难治性AL，降低复发率延长患者长期存活时间，但并未提高患者完全缓解和治愈率。
2.补肾解毒通络法方药可以促进CFU-F和CFU-GM增殖，对K562白血病干细胞增殖和凋亡无明显影响，因此说明补肾解毒通络法对白血病干细胞（LeukemiastemcellsLSCs）无杀伤作用，阻止AL复发存在其他途径。
3.补肾解毒通络法方药可能通过促进骨髓有核细胞增殖，增加MSCs分泌IL-8，上调CXCL12、Jagged1、SCF、Ang-1表达调控MSCs修复骨髓微环境，阻止白血病骨髓龛诱导造血干细胞（HematopoieticstemcellsHSCs）恶化为白血病干细胞（Leukemiastemcells，LSCs），发挥防止白血病复发的作用。
评价补肾解毒通络法（BushenJieduTongluoMethodBSJD）治疗复发/难治性急性白血病（AcuteleukemiaAL）的临床疗效，探讨补肾解毒通络法调控骨髓微环境防止复发/难治性AL复发的作用机制研究。
方法：
研究一，收集2013年5月到2019年3月于天津中医药大学第一附属医院血液科住院治疗且分别符合急性髓细胞白血病（AcutemyeloidleukemiaAML）、急性淋巴细胞白血病（AcutelymPhoblasticleukemiaALL），骨髓增生异常综合征（MyelodysplasticsyndromeMDS）继发AML诊断标准的复发/难治性AL患者，依据补肾解毒通络使用与否分为西药对照组，补肾解毒通络组（西药＋补肾解毒通络组），非补肾解毒通络组（西药+非补肾解毒通络组），应用卡方检验比较三组化疗疗效，有效率、生存期情况。研究二，采用健康C57小鼠32只，经射线照射与否（IR±），随机分为4组。正常对照组（IR-NS），模型照射组（IR+NS），补肾解毒通络组（IR-BSJD），补肾解毒通络照射组（IR+BSJD），每组8只。照射组予5Gyγ射线照射后，分别予相应药物连续灌胃28d后脱颈处死小鼠，分离骨髓单个有核细胞进行原代培养，计数各组骨髓有核细胞及粒、巨噬细胞克隆形成单位（Colony-formingunit-GranulocyteMacrophageCFU-GM），成纤维细胞克隆形成单位（Colony-formingunitFibroblastCFU-F）；各组骨髓间充质干细胞（MesenchymalstemcellsMSCs）传至3~4代，再分别与K562白血病干细胞共培养24h后，经CCK-8检测各组K562细胞及K562对照组（K562白血病干细胞单独培养组）细胞增殖，FCM检测细胞凋亡、周期。研究三，补肾解毒通络法作用后的MSCs与K562白血病干细胞共培养24h后，经Elisa检测各组培养液上清IL-8分泌水平，qRT-PCR检测与K562白血病干细胞共培养前、后MSCs的Ang-1、CXCL12、Jagged-1、SCF基因表达。
结果：
1.87例复发/难治性AL患者，补肾解毒通络组33例：完全缓解（CompleteremissionCR）48.5%（16/33），部分缓解（PartialremissionPR）24.2%（8/33），未缓解（Non-remissionNR）27.3%（9/33），总有效率72.7%（24/33）；非补肾解毒通络组29例：CR17.2%(5/29)，PR38%（11/29），NR44.8%（13/29），总有效率55.2%（16/29）；西药对照组25例：CR32%（8/25），PR24%（6/29），NR44%（11/29），总有效率56%（14/29）。三组CR率和总有效率无统计学差异（P=0.116＞0.05）。
2.对87例患者随访观察，补肾解毒通络组33例患者中，生存期≤1年30.3%（10/33）、1＜生存期≤3年33.3%（11/33）、生存期＞3年36.3%（12/33）；非补肾解毒通络组：生存期≤1年44.8%（13/29）、1＜生存期≤3年48.3%（14/29）、生存期＞3年6.9%（2/29）；西药对照组，生存期≤1年56%（14/25），1＜生存期≤3年36%（9/25）、生存期＞3年8%（2/25）。三者长期存活率比较分析有差异(P=0.02＜0.05)。补肾解毒通络组能明显延长患者生存期：补肾解毒通络组对比西药对照组，P=0.024＜0.05；补肾解毒通络组对比非补肾解毒通络组，P=0.020＜0.05。
3.培养中K562细胞CD45+/CD33+白血病干细胞占总细胞95.3%，镜下细胞表面呈瘤状突起，核仁多。小鼠骨髓分离有核细胞：IR-NS：4.7×107个/ml，IR+NS组：4.0×107个/ml，IR-BSJD组：5.6×107个/ml，IR+BSJD组：4.8×107个/ml。IR-BSJD组和IR+BSJD组骨髓有核细胞数均高于IR-NS组和IR+NS组。CFU-GM：IR-NS组：31.67±2.03个，IR+NS组：29±3.46个，IR-BSJD组：40.67±1.45个，IR+BSJD组：36.33±1.86个，IR-NS组与IR-BSJD组比较具有统计学意义（P=0.0226＜0.05）。MSCs镜下示单层贴壁细胞，呈梭形紧密排列，CFU-F：IR-NS组：41.33±2.33个，IR+NS组：22.33±1.45个，IR-BSJD组：48±2.08个，IR+BSJD组：27.67±1.76个。IR-BSJD组和IR+BSJD组克隆数均高于IR-NS组和IR+NS组，但统计学无明显差异（P=0.1，0.0799）；组内有明显差异：IR-NS组和IR+NS组比较：P=0.0023＜0.05，IR-BSJD组与IR+BSJD组相比P=0.0017＜0.05，差异有统计学意义。
4.与其他共培养组相比，K562对照组CCK8的OD值均明显增高，IR-BSJD组与IR-NS组比较有统计学差异（P=0.0178＜0.05）。K562对照组中处于G0/G1细胞与其他共培养组比较，不具有统计学意义（P=0.935＞0.05），余各组之间未见明显差异。K562对照组细胞凋亡率与其余各组比较，未见明显差异（P=0.797＞0.05）。
5.MSCs分泌IL-8水平，共培养各组与MSCs对照组、K562对照组比较明显升高，差异具有明显统计学意义（P＜0.05）。辐射损伤小鼠中BSJD组与NS组对比MSCs表达Ang-1、CXCL12、Jagged1、SCF四种基因水平明显上调。各组与K562白血病干细胞共培养后，CXCL12、Jagged1、SCF表达均下调，Ang-1表达则上调，BSJD组和NS组相比，四种基因表达水平明显上调。
结论：
1.补肾解毒通络法治疗复发/难治性AL，降低复发率延长患者长期存活时间，但并未提高患者完全缓解和治愈率。
2.补肾解毒通络法方药可以促进CFU-F和CFU-GM增殖，对K562白血病干细胞增殖和凋亡无明显影响，因此说明补肾解毒通络法对白血病干细胞（LeukemiastemcellsLSCs）无杀伤作用，阻止AL复发存在其他途径。
3.补肾解毒通络法方药可能通过促进骨髓有核细胞增殖，增加MSCs分泌IL-8，上调CXCL12、Jagged1、SCF、Ang-1表达调控MSCs修复骨髓微环境，阻止白血病骨髓龛诱导造血干细胞（HematopoieticstemcellsHSCs）恶化为白血病干细胞（Leukemiastemcells，LSCs），发挥防止白血病复发的作用。