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利钠肽是新近发现的一个多肽家族,其结构域是由二硫键连接的两个半胱氨酸构成的17个氨基酸的环状结构。其生理学功能主要有维持水盐平衡、保持血压稳定等,也与心血管、肾脏的器官功能密切相关。新近设计出的利钠肽分子血管钠肽(VNP),由C一型利钠肽和A.型利钠肽的功能结构域嵌合组成,具备两种利钠肽分子的优势功能。
采用分子生物学方法,利用PCR技术扩增VNP基因,对PCR产物进行纯化,纯化后的片段与质粒pGEX-4T-1采用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,连接并将VNP片段插入到表达载体pGEX-4T-1中,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-VNP。利用菌落PCR方法对重组质粒进行鉴定,测序结果表明克隆得到的VNP基因序列与预期基因序列完全一致。
重组质粒pGEX-4T-1-VNP转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,采用IPTG低温诱导方式,融合蛋白GST-VNP表达量较高,且为胞内可溶性表达。GST亲和层析一步便能得到较纯的融合蛋白,HPLC检验纯度为95％。经肠激酶酶切以及去除标签蛋白GST后,超滤离心能得到电泳纯的重组VNP蛋白,最终每升发酵液可获得20 mg重组VNP蛋白。质谱分析得到VNP的分子量为2864.69 Da。WB鉴定以及N端测序均证明所得为重组VNP蛋白。
重组VNP蛋白的活性检测采用动物和细胞两套模型来验证。动物模型上,利用离体血管环张力测试和去膀胱尿液收集法对VNP的活性测定为:在扩张血管方面ANP
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本文以泻心
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