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病毒杀虫剂作为农业、森林害虫防治的生物农药,长期受到人们的重视。它对人、畜及其他脊椎动物无害,不污染环境,同时具有防效时间长,使用方便等优点。然而,由于其杀虫速度慢,对高龄幼虫活性低,杀虫谱窄等方面的缺陷而限制了它在更大范围的应用。本文利用将杆状病毒增效蛋白分别包装到多角体蛋白和多角体释出病毒(ODV)囊膜的方法,构建了多种重组苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus,AcNPV),以期增强杆状病毒的杀虫活性。
第一章:引言。概括介绍了杆状病毒生物学、分子生物学研究进展和应用研究情况,杆状病毒增效蛋白的发现、特性以及应用以及AcNPVODV-E66和松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimuspuntatuscytoplasmicpolyhedrosisvirus,DpCPV)VP3蛋白的特性。
第二章:含增效基因的重组AcNPV的构建及生物活性分析。Enhancin是一种金属蛋白酶,能够增强杆状病毒和苏云金芽胞杆菌对鳞翅目昆虫的感染性。本文利用杆状病毒的Bac-to-Bac系统,将舞毒蛾核多角体病毒(Lymantriadisparnucleopolyhedrovirus,LdNPV)enhancin1基因插入不含增效基因的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcNPV基因组中,同时将增效基因与松毛虫质型多角体病毒VP3N端的79个氨基酸(vp3)或AcNPVODV-E66N端的23个氨基酸(e66)融合,将增效蛋白分别包装到多角体蛋白或者ODV的囊膜上,构建重组病毒。通过PCR验证、显微镜观察实验,证实含enhancin1的重组AcNPV(分别命名为Ac-en1、Ac-e66-en1、Ac-vp3-en1),以及相应的对照病毒(Ac-gfp、Ac-e66-gfp、Ac-vp3-gfp)均构建成功。将Ac-en1、Ac-e66-en1、Ac-vp3-en1、Ac-gfp、等重组病毒喂食3龄初甜菜夜蛾,生测结果表明Ac-vp3-en1的毒力是Ac-en1的2倍,是Ac-e66-en1的3倍。然而,Ac-vp3-en1、Ac-en1、Ac-e66-en1的毒力均明显低于Ac-gfp对照病毒。
第三章:LdNPVEnhancin1蛋白的多克隆抗体制备和定位分析。在大肠杆菌中利用pET-28a(+)-en载体表达了LdNPVEnhancin1的第131-335个氨基酸的截短序列。用His单克隆抗体免疫检测到目的蛋白带大小为29.5kDa。将原核表达的蛋白经镍柱纯化后免疫家兔,得到特异性较好的兔抗血清。利用GFP小鼠单抗和制备得到的Enhancin1多抗分别对含gfp和enhancin1基因的病毒包涵体、包涵体蛋白、病毒粒子、病毒囊膜、核衣壳等组份进行免疫检测,结果显示:e66膜定位序列和vp3多角体蛋白识别序列分别能介导GFP和Enhancin包装于病毒囊膜和多角体蛋白。