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核酸疫苗(nucleic acid vaccine),又称DNA疫苗,是近年发展起来的疫苗构建技术,理论上能够诱发良好的细胞免疫和体液免疫,并具有安全价廉、制备简便、易于生产、便于贮存和运输等诸多优点。但是单纯的DNA疫苗并不足以引发良好的免疫效果,尚需结合其他手段例如基因佐剂,特别是细胞因子佐剂,利用细胞因子上调机体免疫水平的作用,以增强DNA疫苗的效能。在众多的细胞因子中,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)因可促进巨噬细胞及树突状细胞(dendritic cell,DC)的浸润、成熟和活化,进而提高免疫系统的抗原提呈能力,增强疫苗的免疫效果,在诸多研究中已被证实是良好的基因佐剂。同时,GM-CSF也是一种众所周知、具有多项潜能的造血生长因子,可以促进造血干细胞增殖分化、成熟等,并且可以活化免疫细胞,诱导体液免疫和细胞免疫,提升自然免疫中效应细胞的杀伤能力,目前临床上主要是作为骨髓激动剂用于调节骨髓造血功能和机体免疫等。
然而,本实验室在前期关于日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)DNA疫苗的研究工作中发现,JEVDNA疫苗与GM-CSF质粒共同接种不仅没有增强,反而明显抑制了免疫应答反应。为进一步探讨这种抑制现象是否具有抗原特异性,本实验以同属于黄病毒家族的登革病毒(Denguevirus,DV)1型和2型prM/E核酸疫苗及丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus,HCV)结构蛋白E1和C质粒作为候选疫苗,以GM-CSF质粒作为佐剂进行免疫接种,通过ELISA及间接免疫荧光染色(immunofluorescence assay,IFA)检测免疫后小鼠血清抗体水平,同时实施攻毒实验,比较有无共同接种佐剂GM-CSF组间免疫效果和免疫保护作用的差异,从而明确GM-CSF在黄病毒DNA疫苗诱导的免疫应答中的作用,并以此分析其作为黄病毒.DNA疫苗佐剂的可能性。
主要的实验流程与结果如下:
1.GM-CSF抑制DV1及DV2prM/E核酸疫苗诱导的免疫应答反应,且以DV1prM/E核酸疫苗更为显著
(1)动物免疫
将6周龄雌性BALB/c小鼠分为疫苗组、佐剂组及对照组。其中,疫苗组小鼠接种DV1或DV2prM/E核酸疫苗以及空载体pCAGGSP7,佐剂组小鼠共接种DVl或DV2prM/E核酸疫苗以及GM-CSF质粒,对照组接种空载体pCAGGSP7。免疫方法为双侧股四头肌注射,间隔3周,免疫3次。
(2)ELISA检测抗体水平的动态变化
各次免疫后3周以及末次免疫后3月及6月取小鼠血清ELISA进行抗体滴度检测,结果显示,DV1、DV2疫苗组和佐剂组抗体水平均高于对照组,且从第2次免疫后即有明显升高,并维持在较高水平,直至末次免疫后6个月;但DV1、DV2佐剂组的抗体水平均低于相应疫苗组,其差异有统计学意义,说明GM-CSF质粒在DV1、DV2核酸疫苗诱导的免疫应答反应中呈现了一定的免疫抑制作用。
(3)间接IFA检测抗体水平
以末次免疫后3周小鼠血清作为一抗进行间接IFA检测,结果显示,阴性对照组仅见较弱的背景荧光,疫苗组及佐剂组荧光强度较强,而DV1佐剂组荧光强度较DV1疫苗组略弱,而DV2疫苗组和佐剂组荧光强度未见明显差异,说明添加疫苗佐剂后针对DV1病毒抗原的免疫应答受到一定程度抑制。
(4)免疫保护作用
末次免疫后3周,小鼠分别脑内接种50LD50DV1及30LD50DV2,观察发病及死亡情况,观察期为21天。结果显示,DV1疫苗组、佐剂组以及对照组存活率分别为100%、100%及50%,疫苗组和佐剂组较对照组存活率高,差异有统计学意义,而疫苗组和佐剂组两组小鼠间存活率及发病时间差异不明显;DV2疫苗组、佐剂组及对照组存活率分别为50%、50%及12.5%,疫苗组和佐剂组较对照组存活率高,差异有统计学意义,但疫苗组和佐剂组死亡率及发病时间差异不明显。
2.GM-CSF具有增强HCVC及E1核酸疫苗诱导的免疫应答反应的趋势
(1)动物免疫
将6周龄雌性BALB/c小鼠分为疫苗组、佐剂组及对照组。其中,疫苗组小鼠接种HCV-C或HCV-E1核酸疫苗,佐剂组小鼠共接种HCV-C或HCV-E1核酸:疫苗以及GM-CSF质粒,对照组接种空载体pCAGGSP7。免疫方法为双侧股四头肌注射,间隔3周,免疫3次。
(2)ELISA检测血清抗体水平
末次免疫后3周取小鼠血清利用ELISA进行抗体水平检测,结果显示,HCV-C、HCV-E1疫苗组和佐剂组抗体水平均高于对照组,且佐剂组相对疫苗组抗体水平均有不同程度升高,但差异无统计学意义,即GM-CSF在HCVDNA中不仅未显示免疫抑制作用,相反有一定的提升免疫反应的趋势。而HCV-C、HCV-E疫苗组与佐剂组荧光强度相近,未见明显差异,说明GM-CSF对HCVC蛋白和E1蛋白的DNA疫苗无免疫抑制作用。
(3)间接IFA检测抗体水平
利用质粒HCV-C、HCV-E1转染的细胞,将末次免疫后3周小鼠血清作为一抗进行间接IFA检测,结果显示,对照组仅能观察到极低的背景荧光,而HCV-C、HCV-E疫苗组与佐剂组均呈现较强的荧光,且两组荧光强度相近,未见明显差异,同样说明GM-CSF对HCVC蛋白和E1蛋白的DNA疫苗无免疫抑制作用。
综合上述结果,在DV1及DV2prM/E核酸疫苗中,GM-CSF产生一定程度免疫抑制作用,其中以DV1组较为显著;而在HCV-C、HCV-E1核酸疫苗中,GM-CSF则具有一定程度免疫增强趋势。以上结果提示,GM-CSF作为疫苗佐剂,其作用具有复杂的多样性,因抗原的不同而呈现免疫提升或免疫抑制,因此选择其作为核酸疫苗佐剂时需慎重。