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前言： 脓毒症(sepsis)关键的病理生理机制是促、抗炎介质产生和释放的失衡，引起炎症反应过度激活及凝血机能障碍，该过程中内皮细胞起到核心作用，是凝血启动和炎症反应激活过程中最重要的效应细胞。糖尿病以微血管病变为病理基础，存在内皮细胞损伤及凝血与炎症的激活，在急性炎症刺激下该机体的损伤过程怎样，目前尚不明确。 一些研究表明高血糖带来的不良预后及高死亡率以及胰岛素强化治疗可使ICU危重患者的死亡率降低，给脓毒症患者带来益处，但该观点目前仍存在争议。LPS可通过直接或间接方式损伤内皮细胞引起内皮细胞功能变化如黏附分子表达、细胞因子释放或屏障功能损伤，高糖也可通过多种机制参与内皮细胞功能损害，高糖如何影响LPS刺激下的血管内皮细胞损伤，目前也不清楚。 NO是维持血管内皮细胞功能最重要的一种介质，动态平衡对血管功能起到支持作用。NO在脓毒症机体中具有双刃剑作用，合成过多或过少对机体都有损伤作用。二甲基精氨酸水解酶（Dimethylarginine Dimethylaminohydrolase，DDAH）/非对称二甲基精氨酸（asymmetrical dimethylarginine，ADMA），是近年来发现调节内皮功能的新系统，其参与了脓毒症的内皮细胞损害过程。 一氧化氮合成途径紊乱导致内皮细胞自稳失衡，参与多种疾病的发生。机体不同部位，不同结构存在着精细的调节机制，LPS引起的刺激影响其中任何环节都可造成NO系统的失平衡。目前尚不清楚糖尿病或是危重症患者的应激性高血糖状态是否会加重LPS引起的内皮细胞NO系统的调节紊乱，进而加重肺脏内皮细胞损害。 本研究试图通过链脲佐菌素复制大鼠糖尿病模型，LPS诱发脓毒症观察糖尿病机体对LSP引起肺脏血管内皮细胞功能的影响以及体外高糖刺激下研究对肺脏微血管内皮细胞功能影响，对体内体外在LPS刺激下DDAH/NOS/NO变化进行研究，对脓毒症的发病机制进行探讨。 材料与方法： 一、糖尿病对LPS刺激引起的肺脏血管内皮细胞损伤的影响 （一）动物模型及取材 1、动物分组及模型制备 将64只Wistar大鼠随机分为A、B、C、D四组，分别为正常对照组(n=16)、糖尿病组(n=16)、单纯脓毒症组(n=16)、糖尿病发生脓毒症组(n=16)。STZ按60mg/kg体重一次性腹腔注射，对照组注射同等剂量枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液，48小时后随机血糖≥16.67mmol/l为糖尿病模型成功，饲养4周后。4周组及正常组大鼠禁食12小时后腹腔注射大肠杆菌内毒素LPS，10mg/kg，12小时后取材。 2、取材 动物麻醉成功后，眼球取血留取血标本提取RNA进行Real-time PCR，及右肺下叶切下置于-70℃冰箱待提取RNA进行Real-time PCR;右肺上叶切下，测定肺脏干湿重比;左肺切下至于4％多聚甲醛溶液固定一周HE染色。 （二）全血Tie-2mRAN测定 提取各组大鼠全血中RNA，Real-time PCR测定内皮细胞特异性基因酪氨酸激酶受体-2（endothelium-specific receptor tyrosine kinase2，Tie-2）mRNA表达，以了解循环内皮细胞量。 （三）肺脏组织渗透性测定 各组大鼠尾静脉注射2％伊文思兰(evans blue dye，EBD)，20mg/kg，1小时后，生理盐水冲洗肺血管床，取右肺下叶，称重，加入甲酰胺匀浆机机械匀浆，37℃孵育18小时，12000rpm离心20分钟，取上清620nm测定OD值，按标准曲线求出EBD含量。 （四）测定肺脏干湿重比 了解肺脏含水量右肺上叶切下，吸干表面渗液称重，60℃烤箱烘干72小时再称干重，计算肺脏干湿重比。 （五）血清及肺组织NO含量 Griess法测定血清及肺组织亚硝酸盐含量，间接反映NO含量。 （六）Real-time PCR测定肺组织诱生型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitriteoxide synthase, eNOS)、DDAH2 mRNA水平。 二、体外培养条件下高糖对脂多糖刺激下肺脏微血管内皮细胞通透性影响及DDAH/NO S/NO失平衡在其发生机制中的作用 1、肺脏微血管内皮细胞培养及分组 从液氮罐中取冻存人肺脏微血管内皮细胞，迅速投入37℃水浴箱，快速解冻后离心(1000rpm×5min)，弃上清，分别加入10％小牛血清的高糖(33mM)及低糖(5.5mM) DMEM培养基，接种到培养瓶中，37℃、5％的CO2孵箱培养，每隔2天换液一次，培养5天，加入LPS刺激细胞。 2、MTT法测定细胞增殖及活力 肺脏微血管内皮细胞在高糖浓度(33mM)及正常糖浓度(5.5mM)DMEM培养基中分别培养5天后，LPS0.1，1.0，10，100μg/ml，分别培养0、8、12、24、36小时，每孔加入20μ IMTT溶液，培养终止后加入150μ l二甲基亚砜，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 3、免疫荧光法观察细胞微丝F-actin分布及变化。 4、扫描电镜观察细胞膜窗孔数量及孔径变化。 5、Transwell测定单层内皮细胞对辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase，HRP)通透率。 6、Griess法检测细胞培养上清中一氧化氮(nitrite oxide，NO)含量。 7、免疫印迹法(Western blot)测定细胞DDAH2、iNOS、eNOS蛋白表达情况。 8、统计学分析 SPSS13.0统计软件进行数据分析，所有结果均用x±s表示，率的比较采用卡方检验;计量资料每两组间均数比较采用方差分析(one-way ANOVO)方法，正态分布及方差齐时，两组比较采用LSD法，非正态分布采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 实验结果： 一、糖尿病对脓毒症大鼠肺脏血管内皮损伤的影响 1、肺脏病理结果: A组大鼠肺泡无明显变化，B组大鼠局灶肺实变，肺泡壁及肺泡间隔明显增厚，C组大鼠肺泡壁有所增厚，肺间质增加;微血管增多;D组大鼠变化较B组大鼠炎症反应轻，仅见少量巨噬细胞;肺泡壁及肺泡间隔结构仍可辨认，肺泡隔稍增厚。 2、循环血Tie-2mRNA表达 C组大鼠较A组比较循环血中Tie-2mRNA表达水平有所增高，LPS诱发脓毒症会进一步使其表达增高，D与B组比较升高近4倍，(P＜0.01)。 3、肺脏干湿重比 C组大鼠肺脏干湿重与A组比较无差别，LPS诱发脓毒症使肺干湿重比降低，D组较B组更为降低，(P＜0.01)。 4、肺脏血管通透性 LPS可使肺脏对EBD通透性增加，肺含水量增多，且D组与B组比较更为严重，差别有统计学意义，(P＜0.05，P＜0.01)。 5、血清及肺组织匀浆上清中NO含量测定 B组及D组均表现出血清一氧化氮水平明显增高，但后者水平低于前者，(P＜0.05)。在肺组织中表达，两组均显示出高NO水平，且D组近2倍高于B组，(P＜0.05)。 6、肺脏组织中一氧化氮合酶mRNA表达结果: A、B、C组eNOS表达各组之间均无差异，D组低于A组，(P＞0.05); iNOS表达B、C、D组均高于A组，D组高于B组。(P＜0.05)。DDAH2 mRNA水平D及B组均低于A组，(P＜0.01，P＜0.05);D组低于B组。 二、高糖对LPS刺激下肺脏微血管内皮细胞损伤的影响 1、免疫荧光结果 LPS刺激下高糖组与低糖组比较表现出，F-actin排列紊乱，集束，缩短现象明显。 2、扫描电镜结果 LPS刺激下高糖组与低糖组比较内皮细胞膜窗孔增多，直径增大。 3、Transwell结果 LPS刺激下对HRP通透率，高糖组（2.18±0.14）较低糖组(1.81±0.29)增高，差别有统计学意义，(P＜0.00)。 4、细胞培养上清NO测定 LPS刺激下，高糖组与正常糖组比较表现出产生释放NO增加，前者较后者升高明显， P均＜0.00。 5、Western blot结果 LPS刺激下肺脏微血管内皮细胞DDAH2蛋白表达减少，eNOS蛋白表达减少，iNOS蛋白表达增加;高糖培养会加重LPS刺激下该变化。 结论： 1、STZ诱发糖尿病增加脓毒症循环内皮细胞水平及肺脏微血管通透性，因此糖尿病可加重脓毒症机体内皮细胞损伤。 2、LPS刺激发生脓毒症可使肺组织iNOS蛋白表达增加，DDAH2表达减少，从而使肺脏NO产生增加;糖尿病发生脓毒症可使该紊乱进一步加重，提示严重NO系统调节失平衡是糖尿病脓毒症血管内皮损伤加重的可能机制。 3、LPS刺激肺脏微血管内皮细胞F-actin分布排列紊乱，细胞膜窗孔异常增大增多，因此单层细胞通透性增加;高糖培养可使该刺激损伤变化进一步加重。 4、LPS刺激肺脏微血管内皮细胞iNOS增加、DDAH2表达减少，eNOS表达减少，细胞上清中NO增加;高糖培养使该变化加重，提示高糖引起加重的NO调节紊乱参与肺脏微血管内皮细胞损害的发生。