论文部分内容阅读
EDA片段的两种真核表达载体的构建及其重组多肽的生物信息学分析纤维粘连蛋白(FN，fibronectin)是一种存在于细胞外基质和各种体液的多功能糖蛋白，由上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞及某些肿瘤细胞分泌，在细胞粘附、铺展和迁移过程中发挥作用。纤维粘连蛋白基因含三个可变剪接区，故可因可变剪接形成多种mRNA并翻译形成20余种蛋白异构体。
EDA是三个可变剪接区之一，为单个外显子。EDA+FN及其mRNA的特异性高表达通常伴随着活跃的细胞迁移和增生，如创伤修复、胚胎发育和肿瘤生长，但在正常成人组织中很少有EDA表达。一些实验证实：与EDA-FN相比，EDA+FN有更明显的促进细胞粘附、铺展、迁移和增殖作用；而单独的EDA片段也能直接与整合素受体作用，甚至对EDA-FN有互补功能。有的学者推论EDA作为纤维粘连蛋白的部分结构存在时可以维持其最佳功能构象，但也有人发现EDA片段本身就存在活性位点。此外，采用生物信息学的方法分析了EDA片段的功能并发现了其上的三种模体，这三种模体都与细胞信号转导途径有关，提示了EDA片段的细胞内功能。因此，有必要进一步阐释EDA片段的功能及其机制。
但是，迄今为止，人们一般通过在细胞外基质中加入外源性EDA研究其功能。由于外源性重组多肽生物半衰期短、穿透力弱，难以长期维持稳定浓度，不能建立动物模型，也无法研究其在细胞内的功能。为此，构建了两种EDA片段的真核表达载体，并用生物信息学的方法分析其重组多肽的功能，为未来探讨EDA的细胞内功能和建立动物模型奠定基础。
在本课题中，使用RT-PCR技术从口腔鳞状细胞癌(oral squamous cellcarcinoma)细胞株kb的cDNA中扩增EDA序列，再将带翻译启动子的EDA序列插入pcDNA3.1(+)中合适的位置，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-EDA；然后我们在EDA的5’端添加了一段Igk信号肽序列，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Igk-EDA。分别以PCR和酶切鉴定阳性克隆。两种载体的测序结果经NCBI Blast程序搜索，EDA序列273bp和Igk信号肽序列63bp与Genbank中序列完全同源，说明载体构建成功。根据测序结果分别翻译获得pcDNA3.1(+)-EDA和pcDNA3.1(+)-Igk-EDA重组EDA片段：MEDA和Igk-EDA。信号肽和亚细胞定位预测显示MEDA是非分泌性多肽，定位于胞浆；Igk-EDA是分泌性多肽，定位于胞外，信号肽被水解后形成新的重组多肽DEDA。MEDA、DEDA和人类野生型EDA的序列、结构同源性分析显示三者高度同源，故推论这两种EDA重组多肽能完全发挥人类野生型EDA的功能。因此，pcDNA3.1(+)-EDA．可用于研究EDA的细胞内功能和作用机制，pcDNA3.1(+)-Igk-EDA的构建为今后建立EDA稳定表达细胞系和动物模型创造了条件。而迄今为止，国内外尚未见关于EDA片段分泌性载体构建的相关报道。
本实验还分析了EDA片段的活性位点，综合考虑生物信息学结果和参考文献，推论EDA除I43和H44外还可能有其它活性位点。新活性位点的确定有助于抗体、药物的制备和进行蛋白-蛋白相互作用的研究，也为进一步深入的肿瘤细胞外基质中纤维连接蛋白的功能研究提供了参考。