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目的通过中医理论研究、临床应用研究、实验研究三部分来探讨地芝丸延缓皮肤衰老的作用及机制。理论研究从现代医学、中医学对皮肤衰老的认识、皮肤衰老的病因病机等方面进行探讨;临床研究通过地芝丸的组方、药效、临床疗效观察三个方面进行探讨;实验研究以小鼠为实验动物,制备D-半乳糖致衰老小鼠动物模型,探讨地芝丸对模型小鼠皮肤组织形态学结构的影响、并从细胞分子水平探讨引起表皮层、真皮层衰老的原因,以及对细胞因子、皮肤免疫功能、性激素等方面的影响。研究地芝丸延缓皮肤衰老作用的具体作用靶点,为中医药防治皮肤衰老的机制研究提供理论、临床、实验依据。方法1.理论研究:通过查阅古今文献,从现代医学、中医学对皮肤衰老的认识、皮肤衰老的病因病机等方面进行探讨。2.临床研究:从地芝丸的组方分析、药效研究、临床疗效等方面进行探讨。临床疗效观察选取60例女性患者,随机分为治疗组和对照组,治疗组采用地芝丸内服联合强脉冲光（IPL）治疗,对照组仅采用强脉冲光（IPL）治疗。分别于8周后,12周后应用VISIA皮肤测试分析仪、CK皮肤水分测试仪观察毛孔、皱纹、红色区、色素、皮肤含水量5个指标改善情况。临床症状指标观察采用皮肤衰老评分表量化积分,总疗效判定以仪器测量指标改善情况和临床症状改善情况综合分析,总有效率=（显效人数+有效人数/总治疗人数）×100%。3.实验研究:SPF级2月龄雌性小鼠,质量l822g,60只,随机分为6组:空白组、模型组、VE对照组、地芝丸高剂量组、地芝丸中剂量组、地芝丸低剂量组。于SPF级实验室中分笼、恒温、恒湿饲养。适应性饲养2周后,除正常组外,每天于小鼠颈背部皮肤皮下注射5%D-半乳糖生理盐水液（125mg/kg·d）,连续注射42天,制备D-半乳糖致衰老小鼠模型。造模开始的第四周,地芝丸低、中、高剂量组,依次按6.825g/kg·d、13.65g/kg·d、27.3g/kg·d进行灌胃,VE对照组予维生素E45.5 mg/kg·d灌胃,连续灌胃3周。空白组和模型组以等量生理盐水灌胃。实验结束后,处死小鼠,活检取材,行HE染色,于光学显微镜下观察皮肤组织形态学结构改变,组织匀浆行SOD、MDA检测;免疫荧光法检测D-半乳糖致衰老小鼠表皮角蛋白K19的表达情况,以观察表皮细胞代谢情况;酶联免疫吸附法（ELASA）检测表皮水通道蛋白AQP3的含量变化、以观察表皮水转运能力;ELASA法检测真皮羟脯氨酸（HYP）、透明质酸（HA）、以及胶原蛋白含量,以观察真皮层保湿因子和胶原蛋白含量变化;免疫组化法检测真皮中基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3的表达,以观察胶原合成和降解相关酶的表达变化;免疫组化法检测细胞因子TGF-β1、VEGF的表达,以观察成纤维细胞、胶原合成、血管生成相关的细胞因子表达;免疫组化法检测表皮S100阳性朗格汉斯细胞（S100+LCs）的形态、分布和细胞数量情况,以观察皮肤免疫功能;ELISA法检测血清雌二醇E2、促黄体生成素LH、卵泡生成激素FSH的水平,以观察性激素水平变化。收集数据,进行统计学分析。结果1.临床研究:8周时,治疗组毛孔、红色区、色素、皮肤含水量这4个指标都有改善,皱纹指标无改善;12周时,治疗组毛孔、皱纹、红色区、色素、皮肤含水量均有改善。组间对比显示,治疗组改善均优于对照组,总有效率治疗组高于对照组,P<0.05,差异具有统计学意义。2.实验研究:（1）地芝丸对D-半乳糖致衰老小鼠组织形态学结构的影响:在组织病理学方面:空白组小鼠表皮组织结构完整,厚度匀称,连接紧密。真皮层见波浪状纤维组织,排列有序,分布均匀,真皮乳头清晰。毛囊、皮脂腺分布正常。腺泡细胞结构存在,形态规则,核浆比正常;模型组小鼠表皮厚薄不均,结构不完整,与真皮层界线尚清晰。真皮显著变薄,细胞层数明显减少,胶原纤维排列紊乱,分布不均。皮下组织分界欠清。皮脂腺腺泡细胞结构存在,形态稍不规则,核浆比正常;VE对照组小鼠表皮厚薄较均匀,结构较完整,与真皮层界线较清晰。真皮变厚,细胞层数增多,胶原纤维排列较规则,分布较均匀。皮下组织分界较清。皮脂腺腺泡细胞结构存在,形态稍不规则,核浆比正常;地芝丸低剂量组小鼠表皮厚薄欠均匀,结构欠完整,与真皮层界线尚清晰。真皮变薄,细胞层数稀疏,胶原纤维排列较紊乱,分布不均。皮下组织分界欠清。皮脂腺腺泡细胞结构存在,形态稍不规则,核浆比正常;地芝丸中剂量组小鼠表皮厚薄较均匀,结构较完整,与真皮层界线较清晰。真皮增厚,细胞层数增多,胶原纤维排列较规则,分布较均匀。皮下组织分界较清。皮脂腺腺泡细胞结构存在,形态稍不规则,核浆比正常;地芝丸高剂量组小鼠表皮厚薄均匀,结构完整,与真皮层界线清晰。真皮大幅度增厚,细胞层数密集,胶原纤维排列规则,分布均匀。皮下组织分界清。皮脂腺腺泡细胞结构存在,形态规则,核浆比正常。说明VE组、地芝丸各剂量组对皮肤的组织形态学微观结构有改善作用。定量分析显示:与空白组相比,模型组表皮和真皮厚度显著变薄,具有显著性差异（P<0.01）;与模型组相比,VE组、地芝丸高剂量组表皮层和真皮层厚度显著增厚,具有显著差异性（P<0.01）;地芝丸中、低剂量组表皮层和真皮层厚度增厚,差异具有统计学意义（P<0.05）;与VE对照组相比:地芝丸高剂量组表皮和真皮厚度增厚,差异具有统计学意义（P<0.05）。生化指标:与空白组小鼠相比,模型组SOD活力降低,MDA含量增高,两组之间有显著差异（P<0.01）。与模型组相比较,地芝丸高、中剂量组SOD活力增高,地芝丸高剂量组MDA含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;VE组SOD活力显著增高,MDA含量显著降低,具有显著差异（P<0.01）。（2）地芝丸对D-半乳糖致衰老小鼠K19、AQP3的影响:免疫荧光法检测显示:在荧光显微镜下,红色为胞浆中角蛋白K19荧光染色。空白组小鼠K19蛋白定位于基底细胞胞浆中,呈线性连续表达。模型组K19蛋白在基底细胞胞浆中未见表达。VE对照组K19蛋白在基底细胞包浆中呈中度表达,断续不成线性。低剂量组K19蛋白在基底细胞胞浆中几乎未见表达。中剂量组K19蛋白在基底细胞胞浆中呈中度表达,断续不成线性。高剂量组K19蛋白在基底细胞胞浆中呈高度表达,有线性连续表达趋势。定量分析显示:与空白组小鼠相比,模型组K19表达明显下降,具有显著差异（P<0.01）。与模型组相比较,地芝丸高剂量组K19表达明显增强,具有显著差异（P<0.01）;VE组、中剂量组K19表达增强,差异具有统计学意义（P<0.05）。与VE组相比,地芝丸高剂量组K19表达增强,差异具有统计学意义（P<0.05）。ELISA法检测显示:与空白组小鼠相比,模型组AQP3含量显著减少,两组之间有显著差异（P<0.01）。与模型组相比较,VE组、地芝丸低剂量组AQP3含量增高,差异具有统计学意义（P<0.05）;地芝丸中、高剂量组AQP3含量显著增高,具有显著差异（P<0.01）。与VE对照组相比,地芝丸高剂量组AQP3含量增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）地芝丸对D-半乳糖致衰老小鼠真皮HYP、HA、胶原蛋白含量及MMP-1、MMP-3的影响:ELISA法检测显示:与空白组相比,模型组小鼠HYP、HA、胶原蛋白含量显著降低,差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,VE组、地芝丸高、中剂量组HYP、HA、胶原蛋白含量显著增高,具有显著性差异（P<0.01）;地芝丸低剂量组HYP、HA、胶原蛋白含量增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。与VE组相比,地芝丸高、中剂量组HYP、HA、胶原蛋白含量增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫组化法检测显示:经免疫组化染色,镜下可见棕黄色颗粒为MMP-1、MMP-3阳性表达。结果显示,空白组小鼠胶原纤维排列规则而整齐,MMP-1、MMP-3阳性表达极少。与正常组相比,模型组小鼠MMP-1、MMP-3表达增多,呈深棕黄色,胶原纤维排列稀疏,不规则或散在分布。与模型组相比,VE组、地芝丸各剂量组胶原纤维排列较整齐,胶原纤维数目增多,棕黄色颗粒表达可见不同程度减少,表示MMP-1、MMP-3表达降低。定量分析显示:与空白组相比,MMP-1、MMP-3含量显著升高,具有显著差异（P<0.01）;与模型组相比,VE组、地芝丸中、低剂量组MMP-1、MMP-3含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,地芝丸高剂量组MMP-1、MMP-3含量显著降低,具有显著性差异（P<0.01）;与VE组相比,地芝丸高剂量组MMP-1、MMP-3含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）地芝丸对D-半乳糖致衰老小鼠细胞因子TGF-β1、VEGF的影响:免疫组化法检测显示:空白组TGF-β1阳性细胞主要为表皮细胞、真皮成纤维细胞、毛囊上皮细胞、血管内皮细胞胞浆,表现为棕黄色颗粒。模型组阳性表达细胞均明显减弱,表现为淡黄色颗粒。VE组上述表达部位较模型组稍有增强,显色颗粒为棕黄色。低剂量组TGF-β1阳性细胞表达增强不明显,中、高剂量组在表皮,毛囊上皮,真皮成纤维细胞的表达均增强,表现为棕褐色或深褐色颗粒。空白组VEGF阳性细胞主要为表皮细胞、真皮成纤维细胞、血管内皮细胞的胞浆,表现为棕黄色颗粒。模型组阳性表达减弱,表现为淡黄色颗粒。VE组表皮细胞呈弱阳性表达,显色颗粒为棕褐色。低、中、高剂量组在表皮、真皮成纤维细胞、血管内皮细胞的表达呈弱阳性,表现为棕黄色颗粒。定量分析显示:与空白组相比,模型组TGF-β1表达减弱,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,地芝丸高、中剂量组TGF-β1表达增强（P<0.05）,地芝丸低剂量组、VE组TGF-β1表达无明显改变（P>0.05）;与VE组相比,地芝丸高、中剂量组TGF-β1表达增强,差异具有统计学意义（P<0.05）。与空白组相比,模型组VEGF表达减弱,差异具有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,VE组、地芝丸高、中、低剂量组VEGF表达无明显改变（P>0.05）,差异无统计学意义;与VE组相比,地芝丸高、中、低剂量组VEGF表达无明显改变,差异无统计学意义（P>0.05）。（5）地芝丸对D-半乳糖致衰老小鼠S100+LCs的影响:免疫组化法检测显示:空白组小鼠皮肤组织中可见胞浆和胞膜呈黄褐色的S100+LCs,细胞胞体较小,胞体呈圆形或椭圆形,树突少而短,细胞轮廓清楚,不易见到典型的树突细胞,在表皮及真皮呈散在性分布。模型组S100+LCs胞体变大,零星散在分布在棘层中上部,部分视野下LCs不可见,树突状突起明显减少、缩短或者消失,部分结构不完整,树突少且短,典型的LCs少见。与模型组相比,VE组、地芝丸低剂量组S100+LCs的形态和分布无明显改变。地芝丸中、高剂量组LCs分布较为广泛且均匀,部分聚集在毛囊、皮脂腺区域。LCs形态呈圆形、类圆形、不规则形,树突状突起明显增多,长且细,部分突起可延伸到邻近数个棘细胞间。与空白组相比,模型组S100+LCs细胞数减少,具有显著差异（P<0.05）;与模型组相比,地芝丸高剂量组S100+LCs细胞数显著增多（P<0.01）,地芝丸中剂量组S100+LCs细胞数增多（P<0.05）,VE组、地芝丸低剂量组S100+LCs细胞数无明显改变（P>0.05）;与VE组相比,地芝丸高剂量组S100+LCs细胞数显著增多,具有显著差异（P<0.01）,地芝丸中剂量组S100+LCs细胞数增多（P<0.05）,地芝丸低剂量组S100+LCs细胞数无明显改变（P>0.05）。（6）地芝丸对D-半乳糖致衰老小鼠血清E2、LH、FSH水平的影响:ELISA法检测显示:与空白组相比,模型组小鼠E2水平显著下降,具有显著性差异（P<0.01）,LH、FSH水平显著升高,具有显著性差异（P<0.01）;与模型组相比,地芝丸高剂量组E2水平显著升高（p<0.01）、LH水平下降（P<0.05）、FSH水平显著下降（P<0.01）,地芝丸中剂量组E2水平显著升高（P<0.01）;与VE组相比,地芝丸高剂量组E2水平显著升高（P<0.01）、LH水平下降（P<0.05）、FSH水平下降（P<0.01）,地芝丸中剂量组E2水平升高（P<0.05）,差异具有统计学意义。结论1.理论研究:肺肾阴虚、津液不足是皮肤衰老的主要病因病机,因此需从滋肾润肺、养阴生津出发防治皮肤衰老。2.临床研究:地芝丸理法方药完备,疗效观察证实其可改善面部毛孔粗大、减少皮肤黑色素沉积、提高皮肤含水量、改善毛细血管扩张情况,治疗皮肤衰老疗效明确,值得进一步研究和推广应用。3.实验研究:（1）地芝丸可改善小鼠皮肤组织形态学结构,增加小鼠表皮层、真皮层厚度。还可以增强皮肤自由基防护体系功能,减少皮肤脂质过氧化产物堆积。（2）地芝丸可增加表皮角蛋白K19、水通道蛋白AQP3的表达,从而增加表皮的水转运能力,促进表皮细胞的代谢。（3）地芝丸可增加真皮HYP、HA、胶原蛋白的含量,下调MMP-1、MMP-3的表达,以减少胶原蛋白的降解,促进胶原蛋白的合成。（4）地芝丸可促进细胞因子TGF-β1的表达,以刺激成纤维细胞分裂增殖,促进胶原蛋白的合成。（5）地芝丸可增加S100+LC数量,改变S100+LC形态,改善皮肤免疫功能。（6）地芝丸可增加小鼠血清E2水平、降低LH、FSH水平,综合调节性激素水平。