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前言:
胎盘滋养细胞在人类妊娠早期胚泡植入过程中发挥着重要作用,滋养细胞功能(包括增殖、凋亡、侵袭和迁徙等)适度是生理妊娠建立、维持和适时终止的关键。功能过强可发生滋养细胞肿瘤(如葡萄胎、绒癌等);过弱则可导致妊娠失败(如自然流产、早产等)和病理妊娠(如子痫前期、IUGR等)。
瘦素是由肥胖基因编码的分泌性蛋白质,主要由白色脂肪组织产生,是一种作用于多靶器官、多功能的脂肪细胞因子。它参与糖代谢、胰岛素分泌、青春期发育及生殖调节、甲状腺功能调节、骨代谢、肝脏代谢等。大量研究已证实,妊娠期瘦素水平较非妊娠时升高。近年来有资料显示瘦素可促进妊娠滋养细胞的增殖,抑制其凋亡功能,并参与了促进细胞滋养细胞侵袭的过程。
MicroRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的单链非编码RNA,广泛存在于线虫到人类的真核生物体内。miRNA可以通过与靶tuRNA的3UTR完全或不完全互补配对结合,导致靶基因降解或抑制其蛋白质翻译,从而参与基因的表达调控,在发育、细胞增殖、凋亡、分化以及癌症的发生。随着人们对miRNA研究的不断深入,科学家们预测在人类存在1000多种miRNA分子,1/3的基因表达受到miRNA调控。
关于人类胎盘滋养细胞表达与分泌miRNA的研究刚刚起步。2004年,有学者发现某些miRNA在小鼠和人的胎盘中存在高表达,提示miRNA可能在胎盘生长发育过程中发挥了一定的作用。近年来,有学者发现一类miRNA可能是“胎盘特异性miRNA”(placcnta-spccificmicroRNA,PSmiRNA)。这类PSmiRNA倾向于只在胎盘表达,并可能在胎盘发育不良相关的妊娠合并症的发病机制中扮演重要角色。2009年,LuoSS等发现并在验证了8种PSmiRNA,包括PSmiR-512-3p、PSmiR-517a、PSmiR-517b、PSmiR-518b、PSmiR-519a、PSmiR-1185、PSmiR-1283以及PSmiR-1323。
那么这8种PSmiRNA是否参与了妊娠早期胎盘滋养细胞的功能调节呢?遗憾的是,至今未有研究报道任何miRNA对妊娠早期滋养细胞牛物学行为的调控作用。本研究将通过检测不同侵袭、增殖、凋亡能力的妊娠早期胎盘组织中此8种PSmiRNA的表达量及表达部位;研究初步回答了这个问题。本研究旨在探讨PSmiR-518b与胎盘滋养细胞牛物学功能之间的关系及分子机制。
方法:
第一部分:应用荧光实时定量RT-PCR法,绝对定量8种PSmiRNA在以下三个不同分组中的表达量是否有差异:
1、以妊娠周数作为匹配条件,留取妊娠6～12周,自然流产患者(自然流产组)和正常妊娠人工流产(对照组)妇女胎盘绒毛组织。两组患者妊娠周数、年龄等无统计学差异。2、葡萄胎(葡萄胎组)和正常妊娠人工流产(对照组)的妇女胎盘绒毛组织。3、以妊娠周数作为匹配条件,留取正常妊娠人工流产妇女的胎盘绒毛。分别于妊娠第6周、7周、8周、9周,取重量最大的胎盘绒毛10个(H组)与重量最小的胎盘绒毛10个(L组)。相同孕周的两组绒毛的重量有统计学差异。
应用荧光原位杂交法,观察差异表达的PSmiRNA在早孕胎盘绒毛中的表达部位。找到表达量及表达部位均有意义的PSmiRNA。
第二部分:体外培养HTR-8/Svneo滋养细胞,脂质体2000介导转染差异表达的PSmiRNA的模拟物(mimics)和阻遏物(inhibitor)进入HTR-8/Svneo细胞。活细胞计数法及MTT比色法检测不同分组的HTR-8/Svneo细胞的增殖情况,Transwell法观察HTR-8/Svneo细胞侵袭能力的变化,流式细胞术检测转染前后HTR-8/Svneo细胞凋亡能力的变化。
第三部分:生物信息学软件预测差异表达的胎盘特异性microRNA的潜在的靶基因。通过荧光素酶活性分析及westernblot进一步验证此差异表达的胎盘特异性microRNA的靶蛋白。
结果:
第一部分:我们利用quantitativereal-timeRT-PCR方法检测8种PSmiRNA在具有不同增殖、凋亡及侵袭能力的胎盘绒毛中的表达量。发现PSmiR-518b在倾向于增殖、侵袭不足而凋亡过度的自然流产组中表达增高,而在倾向于增殖、侵袭增强而凋亡不足的葡萄胎组中表达降低;在倾向于增殖不足、凋亡增强的“绒毛重量较小组”中表达增高,而在倾向于增殖增强、凋亡不足的“绒毛重量较大组”中表达降低;且在“出牛体重大于胎龄儿组”较“出牛体重小于胎龄儿组”表达明显减少。进一步的荧光原位杂交观察PSmiR-518b在胎盘绒毛组织中的表达部位发现,PSmiR-518b几乎只在绒毛末端的“滋养细胞层”(胎盘功能的主要行使者)中阳性表达,“绒毛间质”中无表达,提示PSmiR-518b可能与胎盘滋养细胞的功能密切相关。
第二部分:瞬时转染PSmiR-518b的转染效率达到70-80%,转染入PSmiR-518b-mimics的M组HTR-8/Svneo细胞中PSmiR-518b表达明显上调,是对照组的12.10±0.25倍(P＜0.001),转染入PSmiR-518b.inhibitor的Ⅰ组HTR-8/Svneo细胞中PSmiR-518b的表达水平明显下调,是对照组的0.09±0.01倍(P＜0.001),转染入PSmiR-518b-mimicsnegative及miR-518b-inhibitornegative的Mn组、Inc组HTR-8/SVneo细胞与对照组HTR-8/Svnco细胞之间的PSmiR-518b表达无明显统计学差异(图2-1)。表明PSmiR-518b-mimics明显增加了HTR-8/Svneo细胞中PSmiR-518b的表达,而PSmiR-518b-inhibitor则明显抑制了PSmiR-518b的表达。转染了PSmiR-518b-mimics的M组细胞增殖能力变弱,在转染后24小时、48小时和72小时,活细胞计数较转染了PSmiR-518b-inhibitor的Ⅰ组明显减少、吸光度明显降低(P＜0.01)。提示PSmiR-518b可以抑StJHTR/svneo细胞的增殖。流式细胞仪检测发现转染了PSmiR-518b-mimics的M组细胞中的凋亡细胞明显增多(P＜0.01),而PSmiR-518b-inhibitor则明显抑制了HTR-8/Svneo细胞的凋亡。提示PSmiR-518b可以促进HTR-8/Svneo细胞的凋亡。细胞在转染PSmiR-518b-mimics后的transwell实验中侵袭能力明显变弱,M组HTR-8/SVneo细胞穿出transewell小室的细胞数量明显低于I组(P＜0.01)。提示PSmiR-518b可以抑制HTR-8/Svneo细胞的侵袭能力。
第三部分:我通过牛物信息学软件预测PSmiR-518b的潜在的靶基因。发现多种与发现多种与细胞侵袭、增殖、凋亡密切相关的基因。其中一种可能的靶基因——瘦素(Leptin,LEP)引起我们的注意:有大量高质量文献报道LEP可促进妊娠滋养细胞的增殖功能[20],抑制其凋亡功能[21],并参与了促进细胞滋养细胞侵袭的过程[22]。LEP对妊娠滋养细胞牛物学功能的影响方向均与我实验第一、二部分中PSmiR-518b对滋养细胞生物学功能的影响方向相反。因此我们初步选定LEP进行下一步的靶基因鉴定实验。随后的荧光素酶活性分析实验发现共转染LEP3UJTR荧光素酶载体和PSmiR-518b表达载体组的报告基因活性相对于对照组显著降低,在PSmiR-518b的作用下,LEPYUTR荧光素酶载体的荧光活性下调大于75%。由此证明,LEP3UTR区可被PSmiR-518b特异性识别并与之结合。进一步的Westernblot实验发现与对照组相比,实验组的LEP蛋白表达水平显著降低＞40%。表明PSmiR-518b可能在翻译水平抑制LEP的表达,瘦素是PSmiR-518b的靶蛋白。
结论:
胎盘特异性PSmiRNA-518b可能通过抑制瘦素蛋白翻译而抑制胎盘绒毛滋养细胞增殖和侵袭,并促进其凋亡。