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群体感应(quorum sensing,QS)作为一种协调细菌群体行为的调控机制,通过感知外界环境中的信号分子浓度变化调节生物发光、质粒转移、抗生素合成,生物膜形成及毒力因子的表达等许多重要生理学反应,以适应环境的变化。
细菌生物膜的形成可增加致病菌耐受抗生素的攻击能力,引起细菌耐药难以治疗。而开发新药需要较长的时间。阻断细菌信号传递能干扰细菌QS系统,抑制生物膜形成,降低毒力因子的表达,达到生物防治病原菌的目的。细菌QS抑制剂开发已成为工农业和医药等领域的研究热点,受到人们的重视和青睐。这种基于阻断细菌信号交流的抑制剂并不抑制细菌生长。细菌QS受干扰后,其对抗菌药物的灵敏度提高,十分有利于对病原菌的控制。这将可能成为一个新的抗菌治疗和生物防治的新手段。
本研究就是基于这样思考和研究背景,从海洋环境、土壤环境和养殖水环境等不同生态环境中筛选具有明显降解信号分子活性的微生物菌株和我国具有极其丰富的中草药资源中筛选具有明显干扰细菌QS系统活性的细菌QS抑制剂,并研究其特性,为具有潜在应用价值的QS抑制剂的进一步研究提供依据和参考,具有十分重要的理论价值和实际意义。
本研究首次应用虚拟对接的计算机筛选方法筛选QS抑制剂。从传统中药所含的活性成分中挑选46种活性成分构建用以虚拟筛选的数据库。虚拟筛选所使用的软件为DOCK5.3.0,将信号受体蛋白TraR与构建数据库的候选物质进行对接,筛选出具有潜在细菌QS抑制活性的化合物。根据对接打分结果,选择几种活性成分进行随后的生物学验证,评判虚拟筛选结果的有效性和真实性。
生物学实验证明大黄素在20μM时能有效抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成,而不影响菌体生长。浓度梯度实验结果表明,大黄素在30 mM,30 min内能有效降解QS受体蛋白TraR。大黄素与氨苄青霉素配伍抗铜绿假单胞菌能增强细菌对抗生素的敏感性。这一结果有利于进一步认识大黄素在病原菌控制方面的消炎作用机制,具有开发成为适合人类使用的有效QS抑制剂的巨大潜力。
本研究以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的QS模式系统(TraI/R)为模型,采用改进的96孔细胞培养板液体检测和琼脂条固体检测相结合的高通量筛选模型,在反复初筛和复筛的基础上,从不同生态环境中分离纯化的微生物菌株和本实验室保存的现有菌株库中筛选到2个具有明显降解信号分子AHL的菌株ZD03和ZD27。经形态学、生化特性检测和16S rDNA分析,初步鉴定ZD03和ZD27为芽胞杆菌属细菌。进一步实验分析表明,两株菌的QS信号降解活性为胞内的降解酶活性。特性检测结果表明,ZD03和ZD27具有水解蛋白质、淀粉等有机大分子的消化酶活性以及分解氨氮、硝态氮、亚硝态氮和有机磷等大分子活性和抑制溶藻弧菌和鳗弧菌生物膜的形成,显示出可应用于水产健康养殖的潜在应用价值。
根据已报道的AHL降解酶基因aiiA两端序列设计引物,从ZD03基因组DNA中克隆出aiiA基因。序列分析表明,该基因片段大小均为753bp,其和GenBank中已知蜡样芽孢菌等的AHL降解酶基因aiiA同源性达96％以上,编码一条250个氨基酸残基的多肽,分子量为28.1kDa,理论等电点为4.78并建模预测其三级蛋白结构模型。在推导得到的氨基酸序列中,在34-235氨基酸残基位置存在功能结构保守区Lactamase-B。将aiiA基因插入到表达载体pET-17b,构建融合表达载体pET-aiiA,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。SDS-PAGE检测显示AiiA在大肠杆菌BL21(DE3)得到高效表达。诱导表达的重组蛋白ZD03-AiiA有较强的AHL降解活性和抑制弧菌生物膜形成的能力。