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目的：研究双层壳聚糖-胶原/聚醚醚酮-羟基磷灰石支架的制作方法；支架负载骨髓间充质干细胞，定向诱导成软骨细胞表型，探讨CS-COL/PEEK-HA支架作为软骨组织工程支架的可行性。
方法：
1.细胞培养及鉴定：无菌胸骨穿刺针从胫骨近段采取日本大耳白兔的骨髓约5ml，全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells.BMSCs），10％胎牛血清的LG-DMEM作为细胞培养基，在37℃、体积分数为5％的CO2及饱和湿度条件下培养，每周换液两次。取第3代BMSCs，免疫细胞化学测定其细胞表面抗原CD44、CD45，以用作对BMSCs的初步鉴定。
2.壳聚糖-胶原/聚醚醚酮-羟基磷灰石支架制作：首先将PEEK和HA粉末按照70/30质量比混匀，在激光选区烧结机上设计样品直径为5mm，厚度为3mm的圆柱形支架，通过设置烧结参数制作出PEEK-HA支架，将支架放入72孔板（模具）内，取3％的壳聚糖和2％的胶原混合的醋酸溶液倾注入模具中的PEEK-HA支架上，-20℃预冷冻10h，冻干机中冷冻抽干24h制作成双层CS-COL/PEEK-HA复合支架，傅立叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定其理化性质。
3.以BMSCs为种子细胞，以CS-COL/PEEK-HA为支架，构建细胞/支架复合体。将细胞/支架共同培养48小时后，电镜观察细胞在支架上的分布、黏附及生长情况。设置实验组A（6例）和对照组B（6例），A组用含转化生长因子-β1、地塞米松、维生素C和含有15％胎牛血清的HG-DMEM培养基定向诱导，对照组用LG-DMEM继续培养。2周后观察实验组细胞成软骨细胞表型和对照组细胞生长情况，并进行免疫组织化学及生物学的相关检测。
结果：
1.细胞形态学观察及鉴定：细胞在10-14天呈克隆样生长，细胞呈纺锤状、成纤维样。14天后取第3代细胞作CD44免疫细胞化学检测可见阳性细胞主要集中在细胞密度高的区域，胞浆内可见棕黄色颗粒，细胞周围也出现黄染区，CD45检测结果为阴性。
2.CS-COL/PEEK-HA支架的理化性质：CS-COL软骨层样支架孔径为160-380 μ m，平均为270 μ m左右，孔相通性好，支架孔隙率为（76±5.01％）。PEEK-HA支架孔径为100-300μ m，平均为200 μ m左右，孔相通性好，支架孔隙率为（65±4.18％）。傅立叶红外光谱仪测定的数据表明复合支架组成物有典型的壳聚糖、胶原峰，没有发现有聚乙二醇峰。软骨下骨层样支架组成物有典型的PEEK、HA峰。
3.电镜观察和免疫组织化学检测：
BMSCs与CS-COL/PEEK-HA支架共培养48小时后可见多孔支架表面密布细胞，部分细胞己渗入支架孔内呈簇生长，底层细胞已呈梭形黏附在支架上，生长较好。实验组经定向诱导2周后可见细胞形态由长梭形向多边形、多角形、不规则形转化，细胞体积增大变为椭圆形、圆形，此时细胞胞浆丰富，并分泌大量基质，部分细胞出现突起向外伸展黏附生长。对照组，经换液培养2周后可见大部分细胞黏附在支架上，细胞呈成纤维状生长，部分细胞已建立了细胞一细胞连接，表现出良好的生物学活性。免疫组织化学检测：实验组经诱导2周后，Ⅱ型胶原免疫组织化学检测可见支架内细胞呈棕黄色染色，对照组细胞染色阴性。
结论：双层壳聚糖-胶原/PEEK-HA复合支架具有良好的生物相容性和多孔结构，可作为负载骨髓间充质干细胞诱导成软骨细胞的组织工程支架。