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肺癌是临床最常见的肿瘤，患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。肺癌的主要治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等。树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，能够有效激活T淋巴细胞免疫，是肿瘤免疫治疗中的调控关键。在肿瘤微环境中，肿瘤相关树突状细胞(Tumor-associated dendritic cells，TDCs)中脂质过氧化激活内质网应激，引起未折叠蛋白反(Unfolded Protein Response，UPR)，激活下游IRE1α-XBP1通路，产生的剪切型XBP1-s通过靶向多个脂质合成基因，诱导TDCs内脂质的异常积累，表现出未成熟表型和功能障碍，抑制了抗肿瘤免疫。有研究表明，PI3K-AKT-mTOR信号途径在脂质代谢中起重要调控作用，能够通过调节脂肪合成相关基因的表达来调控脂质合成，XBPI过表达会导致P13K/mTOR表达的上调，敲除XBP1后，PI3K/mTOR表达下调，还有研究表明，抑制mTOR2可以下调脂质的生成。
“脂浊”既为病理产物也是致病因素，多归属于中医学“痰浊”的病理范畴。肺瘤平膏是由“全国名中医”朴炳奎教授研制的临床治疗肺癌具有确切疗效的中药复方，具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效，可通过多作用靶点发挥抗肿瘤作用。前期研究表明，肺瘤平膏(FLP)能够明显提高DCs功能，通过调节DCs的抗原递呈功能发挥抗肿瘤效应，并且在调控PI3K/mTOR通路方面具有一定优势。作为肺瘤平膏中化痰类代表药物桔梗的主要有效组分，研究表明，桔梗皂苷D(PlatycodinD，PD)具有明确的抗肿瘤、免疫调节、降脂和抗氧化等功能，并且具有抑制ROS聚集、调节PI3K/mTOR信号的作用。因此，我们推测PD可能是FLP调控脂质代谢逆转TDCs功能的有效组分之一，可能通过抑制TDCs脂质异常堆积逆转TDCs功能，并希望对其效应机制进行初探。
目的:
(1)构建TDCs共培养体系，探究肺瘤平膏在毒胡萝卜素(TG)诱导ERS剪切XBP1s后，对TDCs中脂质含量和功能的影响及作用机制。
(2)初探PD对TDCs的免疫调节功能，及探究TG激活ERS剪切XBP1s后，对TDCs中脂质含量和功能的影响及可能的效应机制。
方法:
(1)小鼠骨髓源树突状细胞的分离、培养，建立体外肿瘤相关树突状细胞共培养模型。
(2)模拟肿瘤微环境，通过FLP含药血清干预TDCs模型后，流式细胞术观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达;通过混合淋巴细胞反应，CCK8检测混合淋巴细胞增殖、流式检测T淋巴细胞亚群活化，Luminex技术检测TDCs细胞因子分泌。
(3)毒胡萝卜素干预TDCs模型，观察TG激活ERS，对IRE1α-XBP1通路的影响，及对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。
(4)FLP含药血清，作用TG干预后的ERS激活后的TDCs模型，观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。
(5)通过Western blot、qPCR技术，检测FLP含药血清对BiP-IRE1α-XBP1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况，探索可能的作用机制。
(6)通过LDH、CCK8检测技术，观察PD对DCs毒性和Lewis肺癌细胞的杀伤能力。
(7)模拟肿瘤微环境，通过PD干预TDCs模型后，观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。
(8)通过构建TG激活ERS后的TDCs模型，观察PD对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。
(9)通过Western blot、qPCR技术，检测PD对BiP-IRE1α-XBP1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况，探索可能的作用机制。
结果:
(1)流式检测诱导后DCs表面分子CDllc+阳性表达比例为76.5％，并与肺癌细胞培养上清共培养，冻融抗原刺激，构建TDCs共培养模型。
(2)在模拟的肿瘤微环境中，FLP含药血清干预后，降低TDCs胞内脂质含量（P＜0.01），提高TDCs表面分子的表达，其中以提高CD80、CD86的表达最为明显(p＜0.05)，FLP刺激共培养淋巴细胞增殖（P＜0.05），明显提高T细胞中Th、CTL细胞亚群比例（P＜0.05），降低Tregs细胞的表达（P＜0.05），提高细胞因子IL-12p70、IFN-γ的分泌（P＜0.05）。
(3)TG作用后，在TDCs培养模型中，BiP-lRE1α-XBP1(t/u/s)通路mRNA、蛋白表达增加(P＜0.05)，脂质含量较模型组增加（P＜0.05），影响TDCs表面分子的表达，MCH-Ⅱ、CD80、CD86的表达均明显降低（P＜0.05）;抑制混合淋巴细胞的增殖能力(P＜0.05)，降低Th、CTL细胞亚群的表达(P＜0.05)，提高Tregs亚群的表达(P＜0.05)，同时抑制细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌(P＜0.05)。
(4)FLP含药血清作用于TG干预后的TDCs，脂质含量明显下降（P＜0.05），恢复TDCs表面分子的表达，其中以提高CD80、CD86表达水平较为明显（P＜0.05），提高TG干预后的混合淋巴细胞增殖能力(P＜0.05)，提高Th、CTL细胞亚群比例(P＜0.05)、降低Tregs细胞的亚群表达(P＜0.05)，促进TG作用后TDCs细胞因子IL-12p70、IFN-γ的分泌（P＜0.05）。
(5)qPCR、Western blot结果显示，对于TG激活ERS后，BiP-IRE1α-XBP1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白表达量增加(P＜0.05);FLP含药血清干预TG作用后的TDCs，FLP+TG组能够显著降低BiP-IRE1α-XBP1通路mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)，对重要脂质调节转录因子XBP1-s，具有降低其mRNA和蛋白表达的作用:同时，肺瘤平膏含药血清作用后，TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降，并且明显降低AKT蛋白的磷酸化水平。
(6)LDH结果显示，30uM以下的PD浓度，对DCs无明显损伤，或影响DCs细胞LDH的释放;CCK-8实验结果显示，PD能够有效杀伤Lewis肺癌细胞，其IC50值在13uM左右。
(7)在TDCs共培养体系中，PD高中低浓度均能够有效降低TDCs中的脂质含量(P＜0.01)，提高TDCs表面MCH-Ⅱ的表达（P＜0.05），提高CD80(PDH、PDM，P＜0.05)、CD86(PDM、PDL，P＜0.05)的表达;PDH较强混合淋巴细胞的增殖（P＜0.05）;PD高中低组均能提高Th、CTL细胞的亚群表达率(P＜0.05)，抑制Tregs亚群表达(PDH，p＜0.05);提高IL-12p70(PDH、PDM，P＜0.05)IFN-β(PDH，P＜0.05)细胞因子的分泌。
(8)TG干预诱导RES后，PD高、中、低剂量组均能降低TG干预后TDCs中脂质含量（P＜0.01）:PDH能够提高表面MCH-Ⅱ的表达（P＜0.05），各剂量组均能提高CD80及CD86的表达(P＜0.05)，PDH具有提高淋巴混合细胞的增殖能力(P＜0.05)，PDH、PDM能够明显提高Th、CTL细胞亚群的表达（P＜0.05），PD各剂量组均能降低Tregs细胞亚群的表达(P＜0.05)，并能促进TDCs分泌IL-12p70(PDH，P＜0.05)、IFN-γ(PDH、PDM，P＜0.05)细胞因子。
(9)qPCR、Western blot结果显示，TG激活ERS后，PD+TG组能够显著降低BiP-IREla-XBPI(t/u/s)通路mRNA和蛋白的表达（P＜0.01），同时，PD+TG组作用后，TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降，其中降低p-AKT磷酸化蛋白表达(P＜0.05)水平作用较为明显。
结论:
基于本实验条件下，我们推测:(1)TG诱导ERS，激活IRE1α-XBP1通路，产生XBP1-s剪切形式，可造成TDCs脂质异常堆积和TDCs的功能障碍。(2)FLP含药血清能够逆转TG激活ERS诱导XBP1剪切造成的TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能障碍。(3)PD可能是FLP发挥改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的有效组分之一。(4)FLP含药血清及其有效组分PD调节改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的作用机制可能是通过调控BiP-IRE1α-XBP1和PI3K-AKT-mTOR通路实现的。
“脂浊”既为病理产物也是致病因素，多归属于中医学“痰浊”的病理范畴。肺瘤平膏是由“全国名中医”朴炳奎教授研制的临床治疗肺癌具有确切疗效的中药复方，具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效，可通过多作用靶点发挥抗肿瘤作用。前期研究表明，肺瘤平膏(FLP)能够明显提高DCs功能，通过调节DCs的抗原递呈功能发挥抗肿瘤效应，并且在调控PI3K/mTOR通路方面具有一定优势。作为肺瘤平膏中化痰类代表药物桔梗的主要有效组分，研究表明，桔梗皂苷D(PlatycodinD，PD)具有明确的抗肿瘤、免疫调节、降脂和抗氧化等功能，并且具有抑制ROS聚集、调节PI3K/mTOR信号的作用。因此，我们推测PD可能是FLP调控脂质代谢逆转TDCs功能的有效组分之一，可能通过抑制TDCs脂质异常堆积逆转TDCs功能，并希望对其效应机制进行初探。
目的:
(1)构建TDCs共培养体系，探究肺瘤平膏在毒胡萝卜素(TG)诱导ERS剪切XBP1s后，对TDCs中脂质含量和功能的影响及作用机制。
(2)初探PD对TDCs的免疫调节功能，及探究TG激活ERS剪切XBP1s后，对TDCs中脂质含量和功能的影响及可能的效应机制。
方法:
(1)小鼠骨髓源树突状细胞的分离、培养，建立体外肿瘤相关树突状细胞共培养模型。
(2)模拟肿瘤微环境，通过FLP含药血清干预TDCs模型后，流式细胞术观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达;通过混合淋巴细胞反应，CCK8检测混合淋巴细胞增殖、流式检测T淋巴细胞亚群活化，Luminex技术检测TDCs细胞因子分泌。
(3)毒胡萝卜素干预TDCs模型，观察TG激活ERS，对IRE1α-XBP1通路的影响，及对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。
(4)FLP含药血清，作用TG干预后的ERS激活后的TDCs模型，观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。
(5)通过Western blot、qPCR技术，检测FLP含药血清对BiP-IRE1α-XBP1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况，探索可能的作用机制。
(6)通过LDH、CCK8检测技术，观察PD对DCs毒性和Lewis肺癌细胞的杀伤能力。
(7)模拟肿瘤微环境，通过PD干预TDCs模型后，观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。
(8)通过构建TG激活ERS后的TDCs模型，观察PD对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。
(9)通过Western blot、qPCR技术，检测PD对BiP-IRE1α-XBP1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况，探索可能的作用机制。
结果:
(1)流式检测诱导后DCs表面分子CDllc+阳性表达比例为76.5％，并与肺癌细胞培养上清共培养，冻融抗原刺激，构建TDCs共培养模型。
(2)在模拟的肿瘤微环境中，FLP含药血清干预后，降低TDCs胞内脂质含量（P＜0.01），提高TDCs表面分子的表达，其中以提高CD80、CD86的表达最为明显(p＜0.05)，FLP刺激共培养淋巴细胞增殖（P＜0.05），明显提高T细胞中Th、CTL细胞亚群比例（P＜0.05），降低Tregs细胞的表达（P＜0.05），提高细胞因子IL-12p70、IFN-γ的分泌（P＜0.05）。
(3)TG作用后，在TDCs培养模型中，BiP-lRE1α-XBP1(t/u/s)通路mRNA、蛋白表达增加(P＜0.05)，脂质含量较模型组增加（P＜0.05），影响TDCs表面分子的表达，MCH-Ⅱ、CD80、CD86的表达均明显降低（P＜0.05）;抑制混合淋巴细胞的增殖能力(P＜0.05)，降低Th、CTL细胞亚群的表达(P＜0.05)，提高Tregs亚群的表达(P＜0.05)，同时抑制细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌(P＜0.05)。
(4)FLP含药血清作用于TG干预后的TDCs，脂质含量明显下降（P＜0.05），恢复TDCs表面分子的表达，其中以提高CD80、CD86表达水平较为明显（P＜0.05），提高TG干预后的混合淋巴细胞增殖能力(P＜0.05)，提高Th、CTL细胞亚群比例(P＜0.05)、降低Tregs细胞的亚群表达(P＜0.05)，促进TG作用后TDCs细胞因子IL-12p70、IFN-γ的分泌（P＜0.05）。
(5)qPCR、Western blot结果显示，对于TG激活ERS后，BiP-IRE1α-XBP1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白表达量增加(P＜0.05);FLP含药血清干预TG作用后的TDCs，FLP+TG组能够显著降低BiP-IRE1α-XBP1通路mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)，对重要脂质调节转录因子XBP1-s，具有降低其mRNA和蛋白表达的作用:同时，肺瘤平膏含药血清作用后，TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降，并且明显降低AKT蛋白的磷酸化水平。
(6)LDH结果显示，30uM以下的PD浓度，对DCs无明显损伤，或影响DCs细胞LDH的释放;CCK-8实验结果显示，PD能够有效杀伤Lewis肺癌细胞，其IC50值在13uM左右。
(7)在TDCs共培养体系中，PD高中低浓度均能够有效降低TDCs中的脂质含量(P＜0.01)，提高TDCs表面MCH-Ⅱ的表达（P＜0.05），提高CD80(PDH、PDM，P＜0.05)、CD86(PDM、PDL，P＜0.05)的表达;PDH较强混合淋巴细胞的增殖（P＜0.05）;PD高中低组均能提高Th、CTL细胞的亚群表达率(P＜0.05)，抑制Tregs亚群表达(PDH，p＜0.05);提高IL-12p70(PDH、PDM，P＜0.05)IFN-β(PDH，P＜0.05)细胞因子的分泌。
(8)TG干预诱导RES后，PD高、中、低剂量组均能降低TG干预后TDCs中脂质含量（P＜0.01）:PDH能够提高表面MCH-Ⅱ的表达（P＜0.05），各剂量组均能提高CD80及CD86的表达(P＜0.05)，PDH具有提高淋巴混合细胞的增殖能力(P＜0.05)，PDH、PDM能够明显提高Th、CTL细胞亚群的表达（P＜0.05），PD各剂量组均能降低Tregs细胞亚群的表达(P＜0.05)，并能促进TDCs分泌IL-12p70(PDH，P＜0.05)、IFN-γ(PDH、PDM，P＜0.05)细胞因子。
(9)qPCR、Western blot结果显示，TG激活ERS后，PD+TG组能够显著降低BiP-IREla-XBPI(t/u/s)通路mRNA和蛋白的表达（P＜0.01），同时，PD+TG组作用后，TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降，其中降低p-AKT磷酸化蛋白表达(P＜0.05)水平作用较为明显。
结论:
基于本实验条件下，我们推测:(1)TG诱导ERS，激活IRE1α-XBP1通路，产生XBP1-s剪切形式，可造成TDCs脂质异常堆积和TDCs的功能障碍。(2)FLP含药血清能够逆转TG激活ERS诱导XBP1剪切造成的TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能障碍。(3)PD可能是FLP发挥改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的有效组分之一。(4)FLP含药血清及其有效组分PD调节改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的作用机制可能是通过调控BiP-IRE1α-XBP1和PI3K-AKT-mTOR通路实现的。