分解植物细胞壁多糖乳酸菌的离子束诱变选育及其特性研究

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本研究考察了分离自新鲜苜蓿样品的乳酸菌利用葡聚糖与木聚糖发酵产酸的能力,结合抑菌活性、莒蓿青贮实验效果筛选优良乳酸菌,以之作为出发菌株使用离子束诱变的方法选育分解纤维素性能优良的乳酸菌突变菌株;研究出发菌株和选育的突变菌株对苜蓿青贮发酵过程中发酵品质的影响,并对它们分解羧甲基纤维素(CMC)的酶活力进行检测,利用实时定量PCR(q-PCR)测定其分解纤维素相关的3个酶基因的表达量。  104株苜蓿自然附生乳酸菌接种于仅含1%葡聚糖和1%木聚糖的溶液中,挑选产酸性能较好的6株菌进行抑菌活性的测定,发现菌株A491和A516对大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella enterica)和李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)均有较好的抑制作用。对两株菌进行理化指标、碳源发酵实验和16S rRNA基因序列分析,并根据recA基因扩增实验结果,将菌株A491和A516鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。  应用菌株A491和A516分别进行苜蓿青贮实验。与其它处理组相比,青贮前期添加菌株A491或A516处理组的pH值下降较快,均在10d时pH值第一次降低到5.0以下(之后回升,再缓慢下降,60d后再次降低到5.0以下)。青贮95d时,与其它处理组相比,添加菌株A491或A516的处理组中大肠杆菌数量较少,乳酸含量较高(P<0.05),未检测到丙酸和丁酸,而氨态氮含量和pH值均较低(P<0.05)。其中,添加菌株A516的处理组中粗蛋白和粗脂肪含量最高(P<0.05),发酵品质较好。有氧暴露5d时,各处理组中的pH值均升高,乳酸含量均下降。与其它处理组相比,添加菌株A491或A516的处理组在有氧暴露的5d内能够较好地保存饲料中粗蛋白、粗脂肪的含量,pH也保持在较低的水平,表明添加菌株A491或A516能够提高苜蓿青贮饲料的有氧稳定性。  将筛选到的菌株A516进行1×1015、5×1015、1×1016 N+/cm2剂量的离子束辐照,发现剂量越大致死率越高,最高达到91.72%。应用刚果红染色法测定菌株对羧甲基纤维素钠的水解能力,从510株第一轮诱变后的菌株中筛选出水解圈较大的菌株T1-9(来自于1×1015N+/cm2剂量辐照),重复上述注入剂量进行第二轮诱变,分别从3个注入剂量诱变后得到的菌株中各挑选100株进行刚果红染色实验筛选出菌株TW3-87(来自于1×1016N+/cm2剂量辐照),应用相同的方法进行第三轮诱变,筛选出突变株TH1-38(来自于1×1015N+/cm2剂量辐照),TH2-77和TH2-80(来自于5×1015N+/cm2剂量辐照),TH3-41和TH3-45(来自于1×1016N+/cm2剂量辐照)。将出发菌株A516和第三轮诱变后筛选的5株突变株进行发酵苜蓿粉实验。与添加出发菌株A516的处理组相比,添加菌株TH3-41或TH3-45的处理组在发酵48h时的pH值较低,表明菌株TH3-41和TH3-45能较好发酵苜蓿粉产酸。  设置不同的处理组(自然青贮、添加商业菌株FG1或YX、添加商业添加剂YX2、添加出发菌株A516、添加突变菌株TH3-41或TH3-45)进行苜蓿青贮应用研究。结果表明,青贮10d时,与其它处理组相比,添加TH3-41或TH3-45的处理组乳酸含量较高(P<0.05),pH值较低(P<0.05),有害菌数量较少,乳酸菌数量较多,说明两株突变株在苜蓿青贮实验的前期能够快速生长并产酸,降低青贮饲料的pH值,抑制有害菌的生长。而青贮65d时,添加菌株A516、TH3-41、TH3-45的处理组pH值显著低于自然青贮组及添加YX或YX2的处理组(P<0.05),乳酸含量显著高于自然青贮组及添加YX或YX2的处理组(P<0.05),丙酸和丁酸含量低于检测线。表明离子束诱变能够提高乳酸菌分解纤维素的能力,使其更有利于苜蓿青贮。  应用二硝基水杨酸(DNS)法测定出发菌株A516、突变株TH3-41和TH3-45及商业菌株FG1和YX的CMC酶活,所有乳酸菌的CMC酶活均较低。但与出发菌株A516和商业菌株FG1及YX相比,菌株TH3-41的酶活较高(P<0.05)。  应用q-PCR法分析了乳酸菌3种相关纤维素酶基因的表达水平,与出发菌株A516相比,突变株TH3-41的内切葡聚糖酶基因(lp_3433)、N-乙酰葡糖胺转移酶基因(murG)和6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因(pbg9)表达量均显著上调(P<0.05)。突变株TH3-45的内切葡聚糖酶基因(lp_3433)和N-乙酰葡糖胺转移酶基因(murG)表达量比出发菌株A516的表达量显著上调(P<0.05)。表明离子束诱变提高菌株分解纤维素的能力方法可行,并为研究突变株的变异机理奠定了理论基础。
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