论文部分内容阅读
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，Fg)是引起小麦赤霉病(Fusarim headblight， FHB)的主要致病菌。伴随着全球温室效应和耕作制度的改变，我国小麦赤霉病的发生不再局限于温暖湿润的长江中下游和东北等传统发病麦区，黄淮海麦区也已成为新的赤霉病流行区域。赤霉病不仅引起小麦产量损失和品质降低，而且在禾谷镰刀菌侵染小麦过程中产生多种真菌毒素，严重危害人畜的健康。研究禾谷镰刀菌与小麦的互作机理，可为发展小麦赤霉病防控新技术，培养抗赤霉病小麦新品种提供信息和资料。
本研究以小麦品种苏麦3号(S3，苗期感病、花期抗病)和安农8455(An，苗期抗病、花期感病)以及禾谷镰刀菌株5035为材料，利用二代测序技术，分析了不同抗性小麦与禾谷镰刀菌互作过程中的转录组，研究了菌株5035不同时期及侵染小麦过程中的小RNA；还结合遗传学和分子生物学方法，鉴定了禾谷镰刀菌的效应子候选基因，主要结果如下：
1.禾谷镰刀菌Fgmil-2的表达与功能研究。构建了18个sRNA文库，测序(small RNA sequencing)分析表明，禾谷镰刀菌5035孢子、菌丝及在侵染小麦过程中可产生36个micro-likeRNAs(milRNA)。其中仅一个milRNA，Fgmil-2，在禾谷镰刀菌分生孢子、菌丝和侵染的小麦麦穗中的表达量达到100TPM(Transcripts per million)；Fgmil-2在孢子中表达最高，在小麦组织中表达量最低。Fgmil-2的序列同禾谷镰刀菌生物素生物合成FgbioH1基因的3′非翻译区(3′-UTR)序列相同。Poly(A)聚合酶介导的快速扩增cDNA末端结合序列分析表明，FgDicer2酶在FgbioH1基因转录本的3′-UTR中的特定位置切割，产生具有典型发夹结构的Fgmil-2前体。因此，Fgmil-2与FgbioH1转录本来自同一个基因的转录产物；Fgmil-2的编码基因，也是它的靶基因。在禾谷镰刀菌中，FgbioH1或FgDicer2基因缺失均不能形成Fgmil-2；Fgmil-2的表达与FgbioH1和FgDicer2的表达呈负相关。FgbioH1基因缺失突变体显著影响禾谷镰刀菌菌丝生长、在小麦中的致病力、脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的生物合成、依赖生物素的羧化酶基因表达。这是真菌milRNA形成和调控的一种新机制。
2.禾谷镰刀菌效应子蛋白r2fx的初步鉴定。通过基因缺失突变体分析，初步鉴定了一个禾谷镰刀菌效应子蛋白r2fx。r2fx为镰刀菌所特有，编码250个氨基酸，具有效应子的一些典型特征，在侵染寄主植物中表达。这个基因敲除的突变体Δr2fx在小麦中的致病力显著增加。在原核中表达的r2fx蛋白，与禾谷镰刀菌孢子共同接种小麦胚芽鞘，可以诱导小麦的抗性，降低病菌在小麦上的扩展。
3.小麦与禾谷镰刀菌互作的RNA-seq分析。提取小麦品种苏麦3号和感病品种安农8455的苗期和花期接种禾谷镰刀菌株5035后的RNA，构建了36个RNA-seq文库。RNA-seq分析结果表明，小麦被禾谷镰刀菌侵染后会激发多条代谢路径参与抗病反应，主要包括：微生物相关分子模式诱导的免疫反应和效应蛋白诱导的免疫反应信号路径；苯丙素合成代谢路径加强木质素单体的合成，木质素单体进一步氧化耦合来加强植物细胞壁结构；合成禾谷类作物特有的抗菌物质苯并恶嗪酮，来抵御禾谷镰刀菌的侵染；诱导多种脱毒基因的表达，通过对病菌毒素的修饰和转运来降低其对寄主的毒性影响。其中与抗性表型(S3花期和An苗期)相关的基因11个，7个为赤霉菌侵染诱导上调基因(受体蛋白激酶，HAIKU2；脱毒基因；硫酸盐转运子；溶血磷脂酶Ⅲ；纤维素合酶A，CellulosesynthaseA；另2个功能未知)，4个为下调表达基因(天冬氨酰-tRNA(ASN)/谷氨酰-tRNA(Gln)酰胺基转移酶亚基A；叶绿体-茎环结合蛋白41kDaA；1,4β-D-木聚糖合成酶；锌指(C3HC4)家族蛋白)。基于这些研究结果，从小麦中克隆了18个受禾谷镰刀菌诱导的抗性基因(包括抗性表型相关的11个基因中的7个上调基因)，构建到拟南芥表达载体pRI101-AN，并转入农杆菌。
本研究以小麦品种苏麦3号(S3，苗期感病、花期抗病)和安农8455(An，苗期抗病、花期感病)以及禾谷镰刀菌株5035为材料，利用二代测序技术，分析了不同抗性小麦与禾谷镰刀菌互作过程中的转录组，研究了菌株5035不同时期及侵染小麦过程中的小RNA；还结合遗传学和分子生物学方法，鉴定了禾谷镰刀菌的效应子候选基因，主要结果如下：
1.禾谷镰刀菌Fgmil-2的表达与功能研究。构建了18个sRNA文库，测序(small RNA sequencing)分析表明，禾谷镰刀菌5035孢子、菌丝及在侵染小麦过程中可产生36个micro-likeRNAs(milRNA)。其中仅一个milRNA，Fgmil-2，在禾谷镰刀菌分生孢子、菌丝和侵染的小麦麦穗中的表达量达到100TPM(Transcripts per million)；Fgmil-2在孢子中表达最高，在小麦组织中表达量最低。Fgmil-2的序列同禾谷镰刀菌生物素生物合成FgbioH1基因的3′非翻译区(3′-UTR)序列相同。Poly(A)聚合酶介导的快速扩增cDNA末端结合序列分析表明，FgDicer2酶在FgbioH1基因转录本的3′-UTR中的特定位置切割，产生具有典型发夹结构的Fgmil-2前体。因此，Fgmil-2与FgbioH1转录本来自同一个基因的转录产物；Fgmil-2的编码基因，也是它的靶基因。在禾谷镰刀菌中，FgbioH1或FgDicer2基因缺失均不能形成Fgmil-2；Fgmil-2的表达与FgbioH1和FgDicer2的表达呈负相关。FgbioH1基因缺失突变体显著影响禾谷镰刀菌菌丝生长、在小麦中的致病力、脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的生物合成、依赖生物素的羧化酶基因表达。这是真菌milRNA形成和调控的一种新机制。
2.禾谷镰刀菌效应子蛋白r2fx的初步鉴定。通过基因缺失突变体分析，初步鉴定了一个禾谷镰刀菌效应子蛋白r2fx。r2fx为镰刀菌所特有，编码250个氨基酸，具有效应子的一些典型特征，在侵染寄主植物中表达。这个基因敲除的突变体Δr2fx在小麦中的致病力显著增加。在原核中表达的r2fx蛋白，与禾谷镰刀菌孢子共同接种小麦胚芽鞘，可以诱导小麦的抗性，降低病菌在小麦上的扩展。
3.小麦与禾谷镰刀菌互作的RNA-seq分析。提取小麦品种苏麦3号和感病品种安农8455的苗期和花期接种禾谷镰刀菌株5035后的RNA，构建了36个RNA-seq文库。RNA-seq分析结果表明，小麦被禾谷镰刀菌侵染后会激发多条代谢路径参与抗病反应，主要包括：微生物相关分子模式诱导的免疫反应和效应蛋白诱导的免疫反应信号路径；苯丙素合成代谢路径加强木质素单体的合成，木质素单体进一步氧化耦合来加强植物细胞壁结构；合成禾谷类作物特有的抗菌物质苯并恶嗪酮，来抵御禾谷镰刀菌的侵染；诱导多种脱毒基因的表达，通过对病菌毒素的修饰和转运来降低其对寄主的毒性影响。其中与抗性表型(S3花期和An苗期)相关的基因11个，7个为赤霉菌侵染诱导上调基因(受体蛋白激酶，HAIKU2；脱毒基因；硫酸盐转运子；溶血磷脂酶Ⅲ；纤维素合酶A，CellulosesynthaseA；另2个功能未知)，4个为下调表达基因(天冬氨酰-tRNA(ASN)/谷氨酰-tRNA(Gln)酰胺基转移酶亚基A；叶绿体-茎环结合蛋白41kDaA；1,4β-D-木聚糖合成酶；锌指(C3HC4)家族蛋白)。基于这些研究结果，从小麦中克隆了18个受禾谷镰刀菌诱导的抗性基因(包括抗性表型相关的11个基因中的7个上调基因)，构建到拟南芥表达载体pRI101-AN，并转入农杆菌。