【摘 要】
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本文拟利用基因转染、RT-PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和蛋白印迹(WesternBlotting，WB)等实验技术探讨β-catenin对成纤维细胞有何作用及作用机制。 研究方法：
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本文拟利用基因转染、RT-PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和蛋白印迹(WesternBlotting，WB)等实验技术探讨β-catenin对成纤维细胞有何作用及作用机制。
研究方法：
利用eDNA文库经PCR扩增获得人截短beta catenin基因，构建质粒SCAT-pcDNA3.0：利用Sofast转染试剂将SCAT-pcDNA3.0质粒转染入人胚肺成纤维细胞(HELF)，收集细胞分别在mRNA和蛋白水平观察如下指标：游走性，胶原Ⅰ、Ⅲ合成量，β平滑肌肌动蛋白、上皮钙粘连蛋白、 MMP-7合成状态。结果分析以电泳条带上灰度值作为表达产物水平的参数。应用SPSS10.0统计分析软件对实验数据进行统计分析。显著检验水准α值取0.05。
研究结果：
用KpnⅠ和Xho Ⅰ双酶切PCR产物并回收该片段。将该片段连接到同样被Kpn I和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.0载体中，转化大肠杆菌DH5 α感受态细菌，挑取阳性克隆进行质粒提取，进行酶切鉴定，并获得阳性克隆。重组质粒测序分析结果与Genebank内β-catenin序列比较，结果表明没有错配。
使用转染试剂Sofast将构建成功表达质粒、pcDNA3.0质粒及对照质粒pEGFP-N1转染入人胚肺成纤维细胞，倒置荧光显微镜下观察对照组出现绿色荧光。RT-PCR及Western Blot检测β-catenin及新霉素抗性基因表达显示：正常细胞及转染空质粒细胞有少量β-catenin表达，而转染SCAT-pcDNA3.0质粒的HELF细胞有强烈的β-eatenin表达；新霉素抗性基因在HELF细胞中无表达，但在转染空载体和转染SCAT-pcDNA3.0质粒的HELF细胞中有较强的表达。
转染SCAT-pcDNA3.0HELF细胞合成胶原Ⅰ较HELF细胞及转染空载体细胞增加，而胶原Ⅲ的合成在转染空载体细胞及HELF细胞有较小区别，但在转染重组质粒细胞中有较高表达。Wnt/β-catenin下游基因MMP-7(matrix metal loproteinas7/matrilysin，MMP-7)，cyclin D1表达增加，MMP-9(matrix metalloproteinas 9)表达没有变化。转染重组质粒HELF细胞合成a-SMA(a平滑肌蛋白，a-SMA)增加，但E-cadherin(上皮型钙粘连素，E-cadherin)合成明显减少。转染SCAT-pcDNA3.0细胞游走性明显增加。
研究结论：
1．β-环素促进胶原合成在肺纤维化发生中起一定作用。
2．β连环素通过高表达MMP-7、cyclin D<,1>、a-SMA、降低上皮型钙粘连素表达发挥致肺纤维化作用。
3．β连环素增加成纤维细胞游走性促进肺纤维化发生。
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