论文部分内容阅读
生长素作为一种激素信号分子，几乎调控了植物生长和发育的各个方面，因此探究生长素信号传递级联反应的精细调控就显得极为重要，也一直是植物领域关注的热点之一。过去的研究发现，细胞膜及内质网定位的生长素结合蛋白ABP1通过感知生长素信号，将信号传递到下游信号元件，从而发挥其生物学功能。然而，最新报道的拟南芥ABP1功能缺失突变体没有呈现出明显的生长发育的表型以及生长素响应缺陷。通常来讲，敲除一个基因没有导致表型的出现，一个可能的原因是存在与其功能冗余的蛋白。在拟南芥基因组中，ABP1基因只有一个拷贝，是否存在与ABP1功能类似的蛋白呢？已有的研究表明，ABP1免疫抑制和ABP1RNA反义抑制突变体同时出现了生长素功能缺失的表型;ABP1过表达转基因株系是一个生长素功能获得性突变体，而ABP1生长素结合位点突变的过表达突变体呈现出对生长素不敏感的表型，这预示着在拟南芥中可能存在与ABP1功能类似的蛋白。 实验室前期的工作发现，拟南芥ABP1蛋白能够与类受体跨膜蛋白激酶TMK形成生长素受体复合体，介导生长素激活下游因子如小G蛋白从而控制细胞形态建成，我们推测ABP1功能类似的蛋白可能通过相似的机制发挥其生物学功能。因此，我们通过采用免疫共沉淀结合N14/N15分子标记质谱分析方法筛选到一个TMK互作蛋白ABL1(ABP1-like protein1)，是拟南芥类萌发素GLPs家族成员。蛋白质氨基酸序列比对分析发现，GLPs家族成员进化上高度保守的结构域Box B与生长素结合蛋白ABP1的生长素结合位点具有高度同源性，暗示着GLPs可能作为拟南芥中ABP1功能类似的蛋白ABL，与ABP1共同调控植物的生长发育以及对生长素的应答反应。 本文通过系统的植物分子生物学、遗传学和生物化学分析方法，选择模式植物拟南芥为研究对象，进行了ABP1功能类似蛋白ABL的鉴定和功能分析。主要的研究结果如下: (1)分子系统进化分析表明ABL7与ABP1亲缘关系最近，ABL1和ABL3与桃树中生长素结合蛋白ABP19和ABP20亲缘关系较近，处于同一个小分枝。ABL1，ABL3和ABL7均含有ABP1中高度保守的生长素结合位点Box A，预示着ABL可能结合生长素小分子，与ABP1共同参与生长素介导的生物学过程。 (2)表型观察分析发现，同ABP1突变体abp1-TD1类似，拟南芥abl7单突变体没有表现出明显的生长和发育的缺陷表型，但abp1-TD1abl7双突变体早期阶段出现子叶畸形，根发育缺陷，生长后期莲座叶发育迟缓，该表型同tmk四突变体非常相似，表明ABL7与ABP1两者存在功能冗余，共同正向调控植物的生长发育过程。此外，abl1和abl3单突变体，abl1abl3双突变体早期阶段子叶发育和根生长正常，根毛长度显著增加，生长后期abl1abl3双突变体莲座叶发育缺陷，叶片边缘向下卷曲，呈现明显的偏上性生长模式。遗传学功能互补实验证实，abl1abl3双突变体莲座叶生长发育的缺陷是由ABL1和ABL3基因功能缺失导致的，该结果表明ABL1与ABL3两者存在功能冗余，参与了植物莲座叶的生长发育过程。 (3)生长素响应分析发现，与tir1-1突变体响应类似，拟南芥abp1-TD1abl7双突变体下胚轴伸长对29℃处理的敏感程度显著降低，生长素处理对abp1-TD1abl7主根生长抑制作用明显减弱，而abp1-TD1和abl7单突变体对生长素响应与野生型类似，表明ABL7与ABP1共同正向调节植物对生长素的响应过程。此外，abl1abl3双突变体主根生长对生长素处理敏感程度显著降低，而abl1和abl3单突变体对生长素抑制主根生长的响应与野生型类似，表明ABL1与ABL3共同正向调节植物主根对生长素的响应。 (4)蛋白互作实验发现，ABL1能够和TMK4发生相互作用，外源添加生长素促进ABL1和TMK4蛋白复合体的形成，但对于生长素结合位点突变形式的ABL1M2和TMK4促进作用不明显，表明ABL1蛋白感知生长素信号对于生长素促进ABL1和TMK4蛋白复合体的形成是十分必要的。此外，我们同时检测到ABL3和TMK4，ABL7和TMK2，TMK3，TMK4均存在相互作用，进一步拓宽了我们对ABP1/ABL和TMK家族互作关系的认识。进一步的表型分析发现，与abl1tmk1-/+tmk4和abp1-TD1tmk1-/+tmk相比，abl1abp1-TD1tmk1-/+tmk4四突变体子叶发育，主根生长和莲座叶发育缺陷程度加重，表明在tmk1-/+tmk4背景下，ABP1和ABL1存在功能冗余，共同调节植物的生长和发育。此外，在生长后期阶段，拟南芥abl1abp1-TD1tmk1-/+tmk四突变体呈现出生长素功能缺失相关的表型，植株矮小，成簇状生长，主茎顶端优势减小，结实率下降。 本文的研究主要揭示了拟南芥ABP1功能类似蛋白ABL的存在，拓宽了我们对ABP1/ABL和TMK家族功能互作的认识，为深入解析生长素信号转导作用机制提供了一个新的切入点。