论文部分内容阅读
扩展青霉菌(Penicillium expansum)是引起多种果实采后腐烂的主要病原真菌,每年造成的经济损失十分巨大。同时,Penicillium expansum还会产生一种毒素patulin,残存于鲜果和加工产品中危害人体的健康。一氧化氮(NO)是一种具有广泛作用的重要信号分子,根据其浓度的变化,兼具细胞毒性和细胞保护的双重功能。通常高浓度的NO对细胞生长具有抑制作用,能够加速细胞衰老和死亡。有研究表明,NO处理对一些病原真菌的生长也具有抑制效果。本文比较系统地研究了不同浓度的NO处理对扩展青霉菌P.expansum孢子萌发力和致病力的抑制效果,并在细胞生物学、生化化学、分子生物学和蛋白质组学水平,探讨了NO抑制扩展青霉菌生长和致病力的可能机理,主要结果如下：
⑴抑菌实验表明,浓度为10 mM的NO供体硝普钠(SNP)对扩展青霉菌(P.expansum)具有显著的抑制作用,其抑制效果与处理浓度和时间呈正相关。通过Propidium Iodide染色等分析,证实了SNP处理的孢子其胞外可溶性多糖、蛋白量和丙二醛含量增加,可溶性蛋白SDS凝胶图谱及极性脂薄层层析图谱变化明显,说明NO处理能够引起P.expansum细胞质膜的损伤,进而抑制P.expansum的生长。
⑵通过荧光探针DCHF-DA(2,7-dichlorofluorescin)和蛋白质羰基化水平检测发现,用20μMNO浓度处理的P.expansum孢子,细胞内的活性氧含量增加,蛋白质的羰基化明显,而且ATP合成减少。表明NO处理是通过诱发病原菌细胞内活性氧含量增加,加速蛋白的氧化伤害,降低病原菌细胞的抗氧化能力和细胞功能,从而抑制了P.expansum的孢子的萌发。
⑶利用透射电镜观察了P.expansum孢子的超微结构,发现NO处理的孢子其细胞核较小,内质网结构破坏,细胞活性较低。说明NO处理抑制病原菌孢子萌发与破坏其细胞结构有关。
⑷通过蛋白质组学研究了NO处理对P.expansum相关蛋白质的表达影响,质谱鉴定分析表明,NO处理6 h后P.expansum的差异表达蛋白主要有10个,如Glutamine synthetase、Amidohydrolase、Nitrilases、Nitric oxide dioxygenase、Heat shock70 kDa protein、Tetratricopeptide repeat domain、Enolase(2-phospho-D-glycerate hydrolase)、Heat shock protein60、K homology RNA-binding domain,其生物学功能涉及到氮胁迫、凋亡信号应答、物质代谢及能量代谢等方面。同时,通过基因的半定量分析进一步验证了蛋白质组学的实验结果。
⑸用NO处理采后番茄(Solanum lycopersicum CV.)果实,发现NO能有效延缓番茄果实颜色转红,推迟呼吸跃变时间,降低呼吸跃变的强度。另外,NO处理还能维持番茄果实内较高的抗氧化酶活性,增强了果实的抗病性,有利于保持茄果实品质。通过RT-PCR的半定量分析,发现NO能抑制6个与衰老相关基因(LeACS2,LeACO1,LePG,LeACS4,LePhy1,LePME)的表达。